概括
气候变化是渐进的，但它也会引起短暂的极端热浪，超过任何生物的热极限。为了研究高耐热性的进化潜力，我们进化了适应低温的南极细菌 ，使其能够在 30°C 下生存，这超出了其祖先的耐热极限。这种高温适应在多个种群中迅速发生。它涉及以高度并行的方式发生的基因组变化，并减轻蛋白质错误折叠的影响。然而，它也面临着生理限制，因为种群不能在 30°C 以上生长。我们的实验旨在通过使用一小群生物体来进行进化救援，其中一小群生物体的大量种群生活在比上限温度低几度的温度下。在极端热浪期间，人口较少且生活在较高温度下的较大生物更有可能灭绝。
介绍
生物种群经历着不断的环境变化，特别是在全球变暖的背景下。自工业化前时期以来，全球平均气温已上升 1°C (1)，预计 21 世纪将上升 0.4°C 至 4.8°C (2)。此外，气候变化与热浪 (3, 4) 的频率和持续时间的增加有关，其中包括海洋热浪。迄今为止，最重要的海洋热浪已持续 10 至 380 天，最大强度范围为高于海面温度 3.5 至 9.5°C (5)。由于持续的气候变化，海洋热浪的频率增加了 20 倍以上。据预测，如果气候变暖持续下去，特别是如果全球气温上升 3°C 或更多，这些热浪的频率、持续时间和强度将会增加 (6)。因此，有机体生长的热上限预计会经历更大的选择压力（7）。目前还不清楚适应性进化是否能够快速扩大热浪响应的热上限（7,8），但硬性生理边界可能会限制热浪的延伸（9,10）。这些边界可能是由温度对生物体的影响引起的，特别是对蛋白质变性和性的膜流影响，单步适应性突变可能无法克服这些影响。
当面临严重的环境压力时，种群可以通过进化适应来避免灭绝，这种现象被称为进化救援（11）。进化救援的成功取决于压力源的严重程度、发生的速度以及种群规模（11-17）。在面临逐渐变化的大量人口中，救援援助成功的可能性更大（13-16）。温度变化是重要的压力源，因为温度会影响生物体的生长和繁殖、其生化反应进行的速度以及其蛋白质的功能 (18)。例如，高于称为熔化温度的温度阈值时，蛋白质会失去其三级结构和功能，这就是蛋白质折叠的生物物理学限制生物体可以生存的温度范围的原因 (19)。热稳定性蛋白质往往富含带电和疏水性残基，后者优先出现在蛋白质核心中，以减少溶剂暴露 (20)。人们对许多生物体对高温的适应进行了研究。研究，包括在野生环境中，例如水蚤和矢车菊，以及在实验室中，实验性地进化果蝇、鱼和大肠杆菌 (1, 10, 18, 21–29)。细菌具有种群大、世代短、基因组小等特点，是研究快速适应高温及其基因组基础的理想候选细菌。适应性进化使大肠杆菌能够在高于其最佳生长温度的温度下提高存活率 (28,29)。它可以快速适应高温（27）。然而，适应超过其祖先温度上限的温度的基因组学基础及其最终失败尚不清楚（30）。
为了研究高耐热性的进化潜力，确定其极限，并确定其基因组基础，我们使用了一种冷适应（嗜冷）细菌。来自适应寒冷环境的生物体研究较少，但具有重要的生态意义。它们包含地球上最大的生物量，因此是全球生物地球化学循环的中心 (31)。适应冷的细菌比嗜温细菌有更大的热安全裕度，即它们的生存温度比它们最大耐受的热量低几度。此外，虽然嗜温细菌以接近环境温度的速度生长最快，但适应冷的细菌在远高于其自然栖息地的温度下生长得更快 (32)。因此，冷适应细菌很可能比恒温细菌更快地适应高温。
结果
使冷适应细菌适应高温
南极伽马蛋白细菌嗜盐菌菌株是研究最深入的冷适应细菌之一 (33)。其基因组由两条染色体和两个质粒组成 (34-36)。它可以在约 2.5°C 和 29°C 的温度下生长，但在 20°C 以上就会出现热应力的迹象 (37,38)。由于 P，浮游卤虫是从南极沿海水域自然分离出来的，在实验室条件下的暴露有限 (34)，我们首先将其适应 15°C 的温度 145 代，然后生长出相对于野生型最小的个体。所有进一步的实验均以浮游丰年虫菌株的快速预适应克隆开始。克隆生长增加的可能原因是其整个 2 号染色体的复制，该染色体编码葡萄糖酸转运蛋白和葡萄糖酸激酶，两者都参与 d-葡萄糖酸的细胞转运和代谢，d-葡萄糖酸是我们体内唯一的物种。生长培养基碳源（表S1）。
从这个预适应的克隆开始，我们挑战浮游丰年虫适应逐渐升高的温度，最终超过野生型菌株的上限，就像热浪一样。简而言之，我们通过分批培养中的连续转移将温度从20°C逐渐升高至22°C、24°C、26°C、28°C、29°C和30°C。同时，我们在15°C（野生型的最佳生长温度）下进化了12个复制对照群体（图1A）。在 30°C 时，即超出野生型和预适应克隆的温度限制（图 S1），种群大小开始显着下降（与 29°C 时的生长相比平均减少 26%，与 29°C 时的生长相比平均减少 37%）。 28°C）。然而，所有种群的种群规模均有所恢复。恢复呈现出典型的 U 形进化救援曲线，其中种群规模先减小后增大（图 1B）。这次救援非常迅速。根据种群数量的不同，仅需 70 至 270 代（图 S2）。总之，在逐渐升高的温度下进化了 900 代后，所有 30 个重复种群都能够在超过祖先温度极限的温度下生长（图 1C 和图 S3）。一般来说，适应 30°C 并不涉及在较低温度下生长的权衡（图 S4 和补充文本），但在个体突变水平上可能存在权衡。
图 1. 适应逐渐升高的温度。
(A) 实验设计。我们在温度逐渐升高的情况下，经过 900 代的进化，从一个预适应的克隆中进化出了 30 个复制种群。为了确定适应气温升高的遗传基础，我们对整个实验中分离的克隆的基因组进行了测序。 (B) 细菌密度，量化为 30 个进化群体中每个细菌培养物在 600 nm (OD 600) 处的光密度，作为时间的函数。每行对应一组数据。背景颜色（参见图例）代表我们测量细菌密度时的温度。 (C) 适应值随着温度的升高而增加。使用初始预适应克隆（蓝线）或适应每个温度的群体（红线）在不同温度下测量 23 小时的生长曲线（参见面板标签）。预适应克隆的生长曲线是12次生物重复的平均值，进化群体的生长曲线是90次生物重复的平均值（30个进化群体每个都有3个重复群体样本）。阴影区域和虚线代表 95% 置信区间。
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在整个实验过程中，适应度不断增加，但相对增加最高的是在最高温度下（图1C），这与之前的实验一致（27）。然而，即使在30°C下进化了300代，我们的种群也未能在更高的温度下生长。不到一半的种群在 31°C 至非常低的光密度下生长，并且没有种群在 32°C 下生长（图 S5）。为了证实这些观察结果，我们恢复了终点群体，并在 30°C 的适应期后在 31°C 下进行了两次连续转移。在这些实验中，尽管我们每 48 小时而不是每 24 小时执行一次串行传输，但端点群体在 31°C 下未能增长。虽然在 31°C 孵育（而非繁殖）的群体在 15°C 孵育后恢复生长，但在 32°C 孵育的群体在 15°C 时不会恢复生长。这些结果表明，生长上限在 30°C 至 31°C 之间，而存活上限则在 31°C 至 32°C 之间。总之，在我们的实验中，我们发现了这种细菌的进化拯救的局限性。
与温度适应相关的遗传变化
为了识别与热适应相关的突变，我们对实验过程中不同时间点（22°、26°、28°和30°C）适应不同温度的群体中分离出的192个单克隆进行了测序，对照群体在15°C时进化。 °C。对于中间时间点和对照群体，我们对每个群体的 1 个克隆进行了测序，对于 30°C 适应的终点群体，我们对每个群体的 3 个克隆进行了测序。我们注意到我们的实验设计的固有局限性，即从高温中分离的克隆比从较低温度中分离的克隆需要更长的进化时间，并且在具有更高背景遗传变异的群体中进化。
我们在测序的基因组（数据文件 S1）中发现了 940 个突变，自从我们从具有已知基因组序列的克隆开始实验以来，所有这些突变都必须是从头开始的。在我们实验的时间尺度上，遗传漂变可以忽略不计，因为我们的种群至少由 10 8 个个体组成。因此，大多数观察到的突变都是有益的，或者是由达到高频率的有益突变引起的。最常见的突变是点突变 (62%)，其次是指数突变 (32%)（表 S2 和数据文件 S2）。在我们鉴定的 585 个点突变中，498 个（85.1%）是错义突变，只有 20 个（3.4%）是同义突变。一半突变导致框内插入和删除，只有 10% 的突变导致框内移位和密码子终止，这可能会破坏蛋白质功能。只有 12% 的突变位于编码区之外（表 S3）。
我们在 30°C 下检测到的每个克隆的新变体数量比在所有其他温度下都要多[秩和检验、双尾错误发现率 (FDR) - 在图 2A 中所有成对比较中调整 P）可能是因为选择强度随着温度升高。这些变异优先出现在与蛋白质周转和伴侣功能相关的基因、细胞壁/膜生物发生以及能量产生和转化中（测试，单尾FDR校正P值≤0.05）（图S6，表S4和补充文本）。高温对细胞生理学的两个主要影响是蛋白质变性和流动性增加导致的膜完整性破坏 (39)。蛋白质周转和伴侣功能以及细胞壁和膜生物发生的突变可能有助于克服这两个问题。
图 2. 遗传变异的数量以及平行进化的发生率随着温度的升高而增加，变异优先在某些类别的基因中积累。
(A) 在每个温度下鉴定出的变异数量的比率，通过自前一个温度以来经过的代数标准化 (×100)。该代数相当于20°C至22°C的232代、22°C至26°C的139代、26°至28°C的182代以及28°至30°C的350代。一代。每个数据点代表一个克隆。 (B) 我们将突变基因分为功能类别（数据文件 S3），并指出基因类别突变发生的每个温度下的每个测序克隆。上横轴显示温度，右纵轴显示功能基因类别。小的彩色垂直线代表每个已测序的克隆。适应 30°C 的克隆按群体分组。每个功能类别旁边的条形图显示了在给定温度下该类别中具有突变的克隆的比例。仅显示部分功能类别；图 S9 显示了完整的列表。
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此外，在高温下我们倾向于观察氨基酸取代，这有助于增加蛋白质稳定性。这些取代减少了甘氨酸和丙氨酸的含量，增加了蛋白质的灵活性，并增加了亮氨酸和异亮氨酸（均为疏水性）的频率，这有助于稳定蛋白质核心（表 S5 和 S6 以及补充文本）(40)。
高度平行的突变集中在少数基因和基因组区域
如果一种新的遗传变异在平行进化的群体中多次出现，那么它特别可能具有适应性。为了确定主要负责进化拯救的突变，我们接下来更详细地研究了 30°C 下发生的平行突变。这些突变的主要目标是 Lon 蛋白酶：90% 的克隆能够适应 30°C 突变的 Lon 基因。此外，87.5% 的克隆含有减少 2 号染色体拷贝数的突变（通过两条遗传途径；图 S7 和 S8、表 S7 和补充文本），85% 的克隆携带一个或多个涉及细胞壁的基因的突变生物合成（其中包括 mipA、lab、bama 和 lpxC）。总的来说，适应 30°C 的所有克隆至少在这三类变体中的一类发生了变化（图 2B、图 S9 和补充文本）。
在亚致死温度（分别为 28°C 和 26°C）下，两种突变龙物种中都出现了减少 2 号染色体拷贝数的突变，并且随着温度的升高而增加（图 2B、图 S9、表 S8 和补充文本）。此外，在不同温度下测量的生长曲线表明，2号染色体的复制有利于低于26°C的生长（图S1），很可能是因为它增加了d-葡萄糖酸（2号染色体含有葡萄糖酸转运体），它是d-葡萄糖酸转运体的唯一来源。我们最小的介质中的碳。然而，在温度高于 26°C 时，复制会减少生长（图 S1）。
总而言之，我们的分析强烈表明，在 30°C 时，两种最常见的突变，即龙的 2 号染色体拷贝数减少，正在推动对高温的适应，对于拯救种群免于灭绝至关重要。此外，我们的观察验证了进化救援理论的预测，即亚致死状态的变化有助于适应致死条件（11）。
蛋白质错误折叠限制了高温耐受性的扩展
Lon 蛋白酶是细菌、古细菌和真核生物中发现的 ATP（5'-三磷酸腺苷）依赖性蛋白酶 (41)。它可降解错误折叠和突变的蛋白质，包括许多调节蛋白 (41)。Lon 蛋白酶可识别疏水基序，这些基序通常位于蛋白质核心，仅在蛋白质错误折叠时才会暴露 (41)。
值得注意的是，在 30°C 下存活的克隆中有 90% 含有 Lon 蛋白酶突变，但更值得注意的是，72.5% 的克隆（来自 20 个不同群体的 58 个克隆）具有完全相同的突变，即插入了三个氨基酸（表 S9）。我们可以排除交叉污染作为这种极端平行性的可能来源，因为我们发现克隆中的插入片段是从非连续孔甚至不同平板上的群体中分离出来的。此外，氨基酸插入是克隆之间唯一共享的突变。因为我们的祖先没有发生突变，所以这些平行突变一定是在我们进化的人群中独立发生的。最合理的解释是，插入位于重复区域（TGC-CGA-CAT-TGG-CGA-CAT），是由DNA复制滑移引起的，从而产生第三个重复单元（TGG-CGA-CAT）。增加。像这样的插入可能会减少蛋白质表达，但印迹实验表明情况并非如此（图S10）。插入也不太可能通过稳定 Lon 蛋白酶而有益，因为它定位于蛋白质表面。使用FoldX（42）软件进行稳定性评估表明该突变不稳定（ΔΔG = 5.523 kcal/mol）。插入发生在 N 端结构域（图 3A 和补充文本），这对于 Lon 与错误折叠的蛋白质底物的结合至关重要 (41)。
图 3. Lon 蛋白酶的突变是适应高温的关键。
(A) 使用 Swiss 模式和 PDB 结构 6v11 () 作为模板，对浮游卤虫 Lon 蛋白酶（氨基酸 253 至 775）的三个氨基酸 (Met-) 插入突变（橙色）进行同源模拟。该结构是同六聚体，其中六个单体中的四个与 ADP（腺苷 5'-二磷酸）结合。插入发生在 N 末端结构域的三螺旋束区域，其颜色为青绿色。 (B) 携带空质粒（灰色）、表达野生型 Lon 蛋白酶的质粒、浮游卤虫（蓝色）或表达突变型（Met-）Lon 蛋白酶的大肠杆菌 BL21 菌株中的最大种群密度 (K)质粒 P，浮游卤虫（红色）。我们对每种大肠杆菌和质粒组合（圆圈）测量了 12 个生物学重复。 mut，突变型；野生型。
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由于浮游卤虫不是模式生物，因此在其基因组中改造特定基因的工具是有限的。为了证实Lon蛋白酶插入突变体具有适应高温的能力，我们在Lon蛋白酶缺陷菌株BL21大肠杆菌中同时表达野生型Lon蛋白酶和插入突变体。因为我们的实验结果预测Lon蛋白酶突变体应该能够促进生长，但只能在高温下进行，所以我们测量了它在30°C、37°C和40°C下对生长的影响。在37°C时，突变没有优势，而在30°C时，野生型和突变型Lon蛋白酶的过表达是不利的（K = 0.740，K long mut = 0.658，K long mut = 0.638，秩和测试，单尾 P 在所有成对比较中，最关键的是，在 40°CE 下，大肠杆菌在表达突变体 Lon 时生长到显着更高的密度蛋白酶（Klont = 0.800， = 0.850，单侧秩和检验，P = 0.006）（图3B，图S11至S13和表S10）。
讨论
虽然进化拯救是避免暴露于环境压力的种群灭绝的关键，但尚不清楚它是否可以拯救暴露于超过其最大耐受温度的种群。我们的实验遇到了进化救援的局限性，这在我们的实验条件下是存在的。具体而言，浮游丰年虫种群适应在 30°C（比温度上限高出 1°C）的温度下生长，但它们无法适应在更高温度下生存。
让浮游卤虫在 30°C 下存活也有助于我们了解是什么阻止了这一温度限制的进一步扩大。最常见的突变发生在 Lon 蛋白酶中，这是一种存在于生命各个领域的蛋白质。 Lon 蛋白酶是蛋白质质量控制机制中的主要蛋白酶，通过表达伴侣和蛋白酶来避免错误折叠蛋白质的积累 (41)。第二丰富的突变减少了 2 号染色体的拷贝数。蛋白质错误折叠的适应度成本随着蛋白质含量的增加而增加 (43)。因此，减少 2 号染色体拷贝数可能会带来健康益处，因为它有助于减少构成生物体基因的数百种蛋白质的数量。 13.5%）表达。值得注意的是，2 号染色体复制增强了低温下的适应性，而仅降低了最高温度下的适应性。 2号染色体的重复在自然群体中尚未有报道，其逆转可能与它们无关，但与我们实验中蛋白质错误折叠的关键作用一致。
极端温度和蛋白质错误折叠之间的联系通过增加蛋白质稳定性的突变进一步加强，例如在最高温度下添加亮氨酸和异亮氨酸残基以及丢失甘氨酸和丙氨酸残基。考虑到所有证据，我们假设适应高温可能会通过 Lon 蛋白酶的突变（这可能会增加错误折叠蛋白的降解）或通过避免蛋白变性的稳定突变来减少错误折叠蛋白的负担。由于这种缓解策略在 30°C 以上失效，因此我们得出结论，在我们的实验中检测到的进化拯救的局限性是由蛋白质错误折叠引起的。然而，我们研究的一个局限性是来自 30°C 适应克隆的基因组数据只能提供限制进化拯救的间接证据。
是什么导致了进化救援的局限性仍然未知。一种可能的情况是，延长温度上限的突变很少见，或者被携带更多不延长温度上限的适应性突变的克隆所取代。另一种可能性是，没有任何单步适应性突变能够克服高温带来的生理限制。后者表明存在硬性限制 (9,10)。即使是硬性限制也可以通过足够的时间来克服，但是这段时间的长度取决于必要的基因改变的数量。例如，大肠杆菌中温度诱导的细胞死亡是由 83 种蛋白质的变性驱动的，其中 14 种是必需的 (44)。基因突变率为每代 10 至 83 个核苷酸突变 (45)。基因的独立突变需要很长的等待时间，即使在大量人群中也是如此。相比之下，在我们的 900 代实验中，浮游卤虫的每个基因组平均只有 9 个新的遗传变异。然而，当环境变化足够缓慢时，即使长时间等待也不被禁止。
在逐渐变得有压力的大量人群中，进化拯救是最容易的（13-16）。然而，即使人口众多也无法避免灭绝（46）。此外，虽然全球气候变化是一个渐进的过程，但它也可能导致突发的极端气候事件，如热浪、飓风和干旱(3,4,47)。此类事件可能对野生物种群产生毁灭性影响，并导致一些当地种群（例如熊蜂、珊瑚、狐蝠和海带森林）的灭绝（46-51）。例如，影响澳大利亚南部大堡礁的海洋热浪使温度超出了海带的耐热性（约 2.5°C（比最高海水温度高出 2.5°C）），导致海带森林消失并被海带草皮取代(49)。
模型预测，如果全球变暖到 21 世纪末达到 3.5°C，海洋热浪的长度、强度和频率将增加，平均持续时间为 112 天，比最高海面温度高 2.5°C (52) 。我们实验的目的是评估种群快速改变其热上限的进化潜力，例如在海洋热浪的背景下。这里的上限是指热再生极限，预计低于致死阈值临界热极限（53）。我们的实验旨在通过使用逐渐变化的环境、大量的小生物体以及生活在高于其最大耐热性的温度下的群体来实现这一目标。能够忍受低几度温度的生物体使得进化救援变得尽可能容易，这从理论上来说应该有助于适应。然而，即使在这些有利的条件下，我们也只能将温度限制延长 1°C，根据预测，如果全球变暖达到 3.5°C，这可能还不够。我们的观察表明，我们研究的生物体的温度上限的演化能力较低，这与热带鱼的最新发现一致 (10)。蛋白质错误折叠是有限进化拯救的一个主要因素。由于进化拯救对于种群较小的大型有机体来说更加困难，因此对这些生物体的拯救限制将更加频繁，特别是如果它们生活在接近其耐热性的温度下并暴露于极端气候事件中，这可能导致极端温度超过其耐热性宽容。
材料和方法
细菌和生长条件
我们从巴斯德研究所生物资源中心获得了浮游丰年虫菌株（）。我们在基本海洋海水培养基 2PO4 (1 g/L)、NH4 (1 g/L)、氯化钠 (10 g/L)、硫酸镁 4·7 h2O (0.2g/L)、氧化亚铁 4 中培养该菌株·7h2O (0.01 g/l) 和氯化钙 2·2h2O (0.01g/l) (pH=7)] (37) 补充d-葡萄糖酸 (0.1%)，15°C，225 rpm，在培养摇床 (HT) 上摇动。我们使用大肠杆菌 DH5α 和大肠杆菌进行克隆和扩增。重组菌株在 LB 培养基中于 37°C、卡那霉素 (30 μg/ml) 存在下生长。 。
预处理实验
浮游卤虫是天然分离物，为了使其适应实验室条件和最小海水介质，我们进行了短期预适应实验。简而言之，我们从 48 孔板 (P-5ML-48-C) 中的一个克隆在 2 ml 基本海洋海水培养基中进化出 12 个复制群体，并与 d-葡萄糖酸盐 (0.1%) 一起孵育。在摇床 (HT) 中以 400 rpm 摇动（VWR 微孔板摇床）。我们每 48 小时将每个种群稀释 100 次，持续 15 天，然后每天稀释，持续 15 天，大约构成了 145 代的进化。
在预适应实验结束时，我们分离了几个单克隆并评估了它们对 48 小时内记录的基本培养基生长曲线的适应性。为此，我们在 48 孔板的基本培养基中将预适应克隆的冷冻原种在 15°C 下培养过夜，同时以 400 rpm 的速度摇动。然后，我们将过夜培养物稀释 100 倍，加入 96 孔板 (TPP 92096) 中最终体积为 200 μl 的基本培养基中，并使用读板器 (Tecan Pro F200) 在 20°C 下每 10 分钟测量 600 次。 nm 处的吸光度。我们使用内部制造的外部冷却器将读板机冷却至 20°C。对于每个克隆，我们使用 R 包 (54)。为了估计生长参数，我们将其相对适合度确定为预适应克隆与野生型克隆相比的最大种群密度的差异。我们选择了相对适合度最高的克隆进行进一步的实验。此后，我们将此克隆称为预适应克隆。
实验进化
我们进化出了 30 个可复制的种群。从预适应克隆中分离出的单菌落，我们在 48 孔板中的 2 ml 基本海洋海水培养基中进行培养，其中含有 d-葡萄糖酸盐 (0.1%)，并在 400 rpm 和 20°C 下摇动。为了减少同一板上孔污染的可能性，我们以棋盘形式排列重复群体，交替含有细菌培养物的孔和仅含有生长培养基的孔（Bouth 2216，BD-Difco）。此外，我们没有使用每个板的外孔，因为我们发现这些孔中的介质蒸发较高。如下所述，我们每天将30个重复群体转移到新的平板上进行繁殖，并逐渐提高温度，在20°C开始实验，经过900代进化后在30°C结束。为了监测对温度的适应情况，我们每 7 天使用平板读数器 (Tecan Pro F200) 测量 23 小时内的生长曲线，以评估不断进化的种群的相对适应性。具体来说，在给定温度下生长的第一天，我们在 96 孔板 (TPP 92096) 中将每个进化群体稀释 100 倍，最终体积为 200 μl，每个进化群体重复 3 次，并记录每个进化群体重复的生长曲线。每日转移一周后，我们重复该过程，但这次我们标准化了培养物的细胞密度，以与焦点温度下生长第一天相同的密度开始生长曲线。我们使用 R 软件包 (54) 用方程拟合数据并估计每个种群的生长参数。我们将相对适应度计算为在给定温度下进化种群与种群增长第一天的最大种群密度之间的差异。如果超过一半的进化种群的相对适应性增加，我们将温度再提高 2°C。如果只有不到一半的人口健康状况有所改善，我们会将当前温度保持一周并重复整个过程。我们不能使用竞争适应度分析来评估适应度，因为我们的祖先克隆不会在 29°C 以上的温度下生长。
对于实验进化过程中的常规培养物转移，我们使用了稀释因子，使我们能够在至少一半的复制群体中保持稳定的群体规模。具体来说，为了避免以可能导致其最终灭绝的速度稀释种群，我们要求种群在转移时间附近达到稳定水平，这是我们通过测量前面提到的每周增长曲线来确定的。在实验过程中，我们将温度提高了6次（22°、24°、26°、28°、29°和30°C）。由于人口增长继续减慢，在较高温度下达到较低的人口密度，因此我们必须随着时间的推移调整稀释因子。具体而言，我们在20°C和28°C之间使用了1：100的稀释系数，在28°C和29°C之间的稀释系数为1:50，在30°C下的稀释系数为1：1。 ：25稀释因子。在20°C下，在20°C下使用46代，在24°C下使用46代，在26°C下使用了93代，在28°C下使用182代，在29°C下使用182代。使用39，在30°C下使用311次。
与我们的30个主要人群并联，我们在15°C的恒定温度下进化了12个对照人群，每天2 mL和100倍稀释。我们选择了15°C的温度，因为它是P.浮游丘脑的最佳温度（34）。我们每周通过准备甘油股来存档所有不断发展的人群。具体而言，我们将1 mL的细胞培养物添加到500 mL无菌60％甘油中，并将所得悬浮液储存在80°C。
我们使用几种方法来控制污染。首先，如果我们观察到仅含甘油的培养基中的生长，我们将重新启动甘油量的实验。其次，为了控制大肠杆菌的可能污染（在实验室中通常使用），我们每周将进化的股票稀释为含有LB培养基（DIFCO）的48孔板。我们在37°C下以400 rpm的速度在37°C的微板振动板中孵育板，持续24小时，并在视觉上检查了任何可观察到的生长。我们没有发现任何这种增长的例子，表明没有发生大肠杆菌。第三，我们每个月对每个不断发展的种群进行聚合酶链反应（PCR），每月具有20μl培养物。我们使用了四组引物：针对P的两组引物，浮游丘脑基因和两组针对E，大肠杆菌基因的引物（表S11）。此外，我们随机选择了5个种群，并测序了16 s核糖体RNA基因，以确认浮游生假单胞菌的不断发展的人群。第四，我们仔细检查了基因组序列数据，以寻找交叉抗合的证据，但是找不到这样的证据。为此，我们计算了每个时间点（22°，26°，28°和30°C）的热图，并检查了克隆簇的热图。对于此热图中聚集的任何克隆，我们确定了它们共享的突变。我们发现所有簇都是由以高度平行方式进化的基因突变引起的（例如，lon蛋白酶和ripa）。
适应30°C的估计成本
为了研究适应30°C是否需要在20°C（我们开始演化实验的温度）进行权衡，我们种植了在20°C下适应30°C的克隆。为此，我们从甘油量开始培养了80 30°C适应的克隆过夜。我们将这些克隆种植在补充了D-葡萄糖酸盐（0.1％）的2 mL最小海洋海水培养基中，并在20°C培养。然后，我们将100倍的通宵培养物稀释为200μl最小培养基，并使用板读取器每10分钟在600 nm（OD 600）下测量光密度，持续23小时。我们对每个克隆进行了5种生物学重复。为了执行这些测量，我们使用外部冷却器将读取器冷却至20°C。
全基因组测序
为了研究温度适应的遗传基础，我们从适应不同温度的种群中分离了克隆（即在实验过程中的不同时间点）。具体而言，我们从生长的最后一天中选择了克隆，在22°，26°，28°和30°C下选择了克隆。这是人口世代数量最多的四个温度。我们使用了补充有0.1％D-葡萄糖酸的微型燃料海洋海水琼脂，以将单个克隆隔离到冷藏中，并为每个孤立的克隆准备新的冷冻库存。为了确认克隆适应特定温度的能力，我们测量了每个分离的克隆的生长曲线。具体而言，我们在2 mL的最小海洋海水培养基中制备了克隆的甘油量的过夜培养物，这些海水培养基补充了D-葡萄糖酸，并在相应的温度下用摇动培养。然后，我们遵循与实验进化相同的方法，将隔夜培养物稀释为最终体积的200μl培养基，并测量板读取器中其23小时的生长曲线。
我们从培养的隔夜（2×10 9细胞）中提取基因组DNA（GDNA），这些克隆在最小的海洋海水培养基中生长的培养（2×10 9个细胞），这些海水培养基补充了0.1％D-葡萄糖酸盐。为此，我们使用了血液和组织试剂盒（）。简而言之，加入蛋白酶K后，我们在56°C下孵育裂解液1小时。然后，我们将缓冲液Al添加到裂解物中，并在70°C下孵育10分钟，然后再添加乙醇。我们在100μLEB缓冲液（）中洗脱了DNA。为了评估提取的GDNA的数量和质量，我们使用了量子荧光计DSDNA广泛区域分析（LIFE）和纳米体（ND -1000， - ）分光光度计在0.7％琼脂糖凝胶上检查DNA的完整性。 。我们使用相同的程序来提取大肠杆菌以克隆目的。
在牛津基因组中心进行了库制备和测序[HISEQ 4000，150碱基对（BP）配对读数]。对于适应22°C，26°C和28°C的种群，我们对每个人群进行了测序，对于适应30°C的种群，我们测序了每个人群3个克隆，除了人口13（琼脂上没有克隆，板）和25（由于技术错误，我们仅获得了两个克隆）。我们总共序列了192个克隆：1p，浮动野生野生型克隆，1p，木板前的适应性克隆，12个对照克隆，30个适用于22°C的克隆，30个适应于26°C的克隆，30 30 30 a克隆为28°C，86克隆，适用于30°C。测序数据，我们更新了（55）之前开发的管道。简单地将我们使用（v.0.11.9）（rrid :)进行初始序列质量控制。然后，我们使用trim-（v0.4.5）（rrid :)和bwa-mem（0.7.17）来修剪读数（56）以映射筛选读取为p，p，弗洛里形成基因组（nc_..1，nc u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u .1（34））包括两个描述的质粒PMTBL（.1）（35））和PMEGA（.1（36））。然后，我们使用（v.2.17.11）（rrid :)重复删除并阅读以gatk（v3.8）（57）（57）重新安排。我们使用（v1.7）（58）和gatk（v3.8）（57）用于可变呼叫，（v0.2.5b8）（59）（59）和厌恶舞者（v1.1）（60）用于结构可变呼叫的结构。我们使用（v4.3t）评论并预测其功能效应（61）。最后，我们使用（v2.2.1）（62）评估测序数据的质量。每个基因组位点读取114次的平均覆盖范围。同时，我们还使用管道brece（0.32.1a版本）（63）来确定实验中发生的突变，并使用我们的内部管道获得了与内部管道相同的结果。我们鉴定出适应30°C的组中的6个超过克隆。它们包括三个克隆（突变的多gen）和第11组（突变Muts Genes）的三个分离。我们从所有进一步的分析中丢弃了这些克隆体。如果该突变在基因起点的上游的上游高于150 bp，我们将其分类为遗传突变。
在某些分析中，我们仅独立考虑突变。在这些分析中，我们仅计算每个突变的计数，即当我们确定其第一个温度时。对于适应30°C的克隆，如果与同一突变相距的三个克隆中有多个克隆，我们只计算一次。
功能富集分析
为了研究我们实验中观察到的突变的功能含义，我们使用p类和基因由同源组COG [] []（64）]，我们从显微镜（）下载。具体而言，对于每个温度和COG类别，我们将在给定温度下给定COG类别的突变比与相应的突变比（但加在一起所有其他温度）以进行比较。为此，我们使用（i）突变构建了一个2×2列表，这些突变在选择温度下分配给查询齿轮类别，（ii）在选择温度（ii）下分配给其他COG类别的突变（ii）（ii）（ii）（ii） ）（ii）iii）在所有其他温度下，分配给查询齿轮类别的突变数量，以及（iv）在所有其他温度下分配给其他COG类别的突变次数。我们使用该表进行了单个尾检查（65）评估统计学意义。我们的假设无效的是，给定COG类别的突变比没有不同的温度依赖性差异。我们使用方法来纠正多个测试（66）。
LON蛋白酶的结构分析
因为第三级结构p，浮游生物lon蛋白酶不存在，所以我们使用同源建模方法获得三级结构P，浮动远型野生型LON蛋白酶以及我们用三个氨基酸插入LON蛋白酶鉴定的LON 。我们使用两个软件包瑞士模型来模拟第三级蛋白质结构（67）和I-（68）。在瑞士模型中，我们使用了序列和P，从Olson的79.12％（79.12％蠕虫）浮动盐水作为同源模型的模板。我们使用了Jemo的第三级结构的可视化（69）。为了评估三种氨基酸在蛋白质稳定性上的插入，我们使用了Foldx算法（42）获得三级结构（68）。为此，我们首先使用foldx中的命令来修复三级结构（42）。然后使用命令优化固定的三级结构。最后，我们使用命令来计算稳定性。我们比较了LON野生型和LON突变体的稳定性，并通过此比较计算了ΔΔG。
印度检测LON蛋白酶表达
为了评估LON蛋白酶野生类型和不同突变版本的蛋白质表达水平，我们进行了密封实验。我们在离心（在室温下为5000 rpm/cents）中收集1 ml细菌培养物，并将颗粒重新限制为4×样品缓冲液（LDS），最终比例为每天100μl600。我们将这些细胞提取物的蛋白质部分分离在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电元凝胶（4％至12％的Proct凝胶，Sigma-）上，并使用Bio-Rad 套件使用制造商的计划使用制造商的计划。转移到聚氟化物膜中。在使用3％脱脂牛奶在磷酸盐缓冲盐盐水（PBS）和0.1％呕吐温度20中孵育1小时后，我们使用PBS和0.1％的Twen 20清洁膜一次，并使用抗-lon蛋白酶抗体（ ：5000稀释）它在4°C下孵育过夜。我们使用PBS和0.1％呕吐温度20洗涤膜每次3次，并使用1：2500稀释的辣根过氧化物酶结合与兔抗体（GE）2小时。最后，我们使用PBS和0.1％的Twen 20来清洁三个轨迹，并使用ECL系统（GE）根据制造商的（）上的制造商的协议（）来冲洗它。
LON蛋白酶在大肠杆菌中的表达
为了确认LON蛋白酶突变在高温适应中的关键作用，我们以最常见的突变（三个氨基酸插入）表示了野生型LON蛋白酶和LON蛋白酶E和大肠杆菌。 S14），它包含用于蛋白质表达的组成启动子OPPA。它具有PUC源，肯那霉素抗性基因和一个编码基因的EYFP（增强的黄色荧光蛋白）（表S12）。简而言之，为了构建这种质粒，我们从/d-topo（，）替换了质粒（70）puc的来源。我们使用完整的颗粒状聚合酶链反应（PCR）去除编码基因的EYFP并获得空控制粒子（请参阅表S11）。接下来，我们从p，浮动的保留野生型（）和p中扩大了Lon-ph重量（野生型LON蛋白酶）和LON PH14.1（用三个氨基酸插入的LON蛋白质酶），以及浮动固定昆虫30°C 30 °C. -14.1克隆（与第14组第14组分开）。然后，我们使用 PCR（71）组装主混合物（新），将这些基因插入中间，并获得两个质粒lonph重量.1（表S12）。
我们将我们设计的三个转换为E和大肠杆菌BL21（DE3）E-（Sigma-），将携带野生蛋白酶的lonph重量.1 lon蛋白酶和携带突变的空气颗粒。该E，大肠杆菌菌株缺乏内源性lon蛋白酶E，大肠杆菌。我们接种了转化的细菌的单个菌落中添加（30μg/ml）的LB培养基，在37°C下培养过夜，振荡220 rpm。我们将文化稀释至.005。在96个洞板（TPP 92096）中，每种培养基都有12个重复，并将其放置在Tecan F200 Pro上，以测量OD来监测Tecan F200 Pro的细菌的生长。我们测量了30°，37°和40°C的生长曲线，以研究不同温度下不同LON蛋白酶对生长E和大肠杆菌的表达的影响。我们正在使用R软件包（54）。据估计，估计每个生长曲线的最大种群密度。
统计分析
我们进行了所有统计分析并使用R（72）。