为了探索乳酸杆菌的抑制作用ET-22（EIET-22）活细菌及其表观遗传成分（热灭活的细菌和分泌物）对念珠菌的念珠菌，Bohai大学食品科学与工程学院Sun Zhe，Gao Hena，Zhang Ming，食品与健康学院，北京技术与商业大学，内蒙古乳品技术研究所有限公司，蒙古乳业技术研究所/蒙古Yili工业集团有限公司，Liu ，Hong ，Hong ，Hong ，Hong ， Zhao Wen评估了乳杆菌ET-22活细菌及其表观遗传成分的抗氧化能力以及木质念珠菌菌丝体转化的抑制率，ICR小鼠的口腔念珠菌疾病模型是通过注射免疫抑制剂和施加念珠菌的抑制率。 。建模前后，ET-22活细菌的剂量为109 CFU/mL，相应的表观遗传成分连续以饮用水形式施用18天。研究了小鼠舌头上乳杆菌ET-22的组织形态和炎症因子表达的作用。 109 CFU/ML乳酸杆菌ET-22的抑制性白色念珠菌抑制率最高，为37.84％；热灭活细菌和表观遗传成分中分泌的抑制率分别为17.50％和28.00％。在动物模型中，在ET-22活细菌和表观遗传成分的干预后，小鼠中的IFN-γ含量显着降低。分泌组显着降低了小鼠舌组织中的IFN-γ和TNF-α。活细菌组的含量仅显着降低了TNF-α含量，活细菌组和热灭活的细菌组显着改善了CCL20趋化因子含量以及小鼠舌组织中舌群的丰富性和多样性。组织病理学切片表明：ET-22可行的细菌和分泌物显着改善了小鼠舌表皮中炎症细胞的松弛层和炎症细胞的浸润；热灭活的细菌对舌头和表皮具有改善作用。实验结果表明，ET-22可以减少小鼠舌组织的炎症浸润和转移，调节舌植物的组成并抑制口腔中有害细菌。研究表明，ET-22通过抑制白色念珠菌降低了口服念珠菌病的风险，并有望进一步发展为具有口腔保健功能的口服益生菌食品。
白色念珠菌是引起口服念珠菌病的主要致病细菌。这是75％健康人口的条件病原体。当宿主防御机制和真菌定殖平衡失调时，唾液中白色念珠菌的含量超过400。口服念珠菌病可能是由CFU/ML引起的[1-2]。当前，口服念珠菌病治疗的主要治疗方法是使用抗真菌药物，主要包括咪唑，多烯烯和棘锥蛋白。这些药物的广泛使用可能导致真菌耐药性恶化，并显着降低该药物的功效，从而导致严重的副作用和高度治疗成本[3]。
随着社会的发展，益生菌是功能性食品的重要功能因素，引起了消费者的广泛关注[4]。益生菌是指微生物制剂，该制剂可以通过足够的摄入量在宿主中发挥有益的作用。因为它抑制了致病细菌的生长和繁殖，优化了肠道微生物菌群的结构，可改善人体的免疫力[5]；消除人体的自由基；改善人体的血脂并降低胆固醇含量[6]和其他生理功能，因此含有益生菌的食物吸引了市场上的广泛关注。当前的研究表明，益生菌主要在牙齿龋齿和牙周炎等口腔疾病中起预防和治疗作用[7-8]。该研究发现，在口服12周的口服含有乳酸杆菌（）和 ATCC PTA 5289（ATCC PTA 5289）之后，在老年人中，唾液中的念珠菌和口腔念珠菌疾病的浓度。发病率降低[9]。最近的研究发现，被称为表观遗传成分的热灭活细菌和活细菌代谢产物对白色念珠菌的生殖和生物膜形成也具有显着的抑制作用[10-11]。与活细菌相比，表观遗传成分在食物中的影响可能更稳定和更高。当前的研究表明，活细菌对动物白色念珠菌感染具有预防作用，但尚不清楚它们的表观遗传成分（热灭活细菌和分泌物）是否具有相似的作用。
在这项研究中，具有预防龋齿和牙周炎的作用的 ET-22是一种实验性菌株[12]。它旨在检测能够抑制白色念珠菌的萌芽和菌丝体转化的能力，并调节动物模型中的免疫系统，并调节动物模型中的免疫系统改变树枝关闭的能力，以及乳酸乳杆菌的抑制作用22探索了活细菌及其在白色念珠菌上的表观遗传成分，旨在为具有口腔健康功能的表观遗传功能食品提供理论参考。
1种材料和方法
1.1材料和试剂
1.1.1菌株和实验动物
内蒙古Yili Group Co.，Ltd。乳杆菌ET-22；白色念珠菌CGMCC 2.4122（2.4122），中国普通微生物新芽保护与管理中心（CGMCC）。 6周龄的SPF级ICR雌性小鼠，50，北京生物技术有限公司，许可证号为SCXK（北京）2019-0008，喂养条件为每天12小时，温度为（20±2） ）℃，湿度为45％至60％。 Puni Co.，Ltd。对动物实验的伦理学评论批准了该实验，并且批准编号为Pony-2021-FL-43。
1.1.2实验试剂
Solid培养基夫人，北京 Co.，Ltd。的媒介；酵母浸出肽葡萄糖肉汤培养基，北京 Co.，Ltd。; MP快速套件用于美国国会议员公司的土壤DNA提取试剂盒； -MPLEX Mouse 检测套件，Bixin （ ）Co.，Ltd。； BCA蛋白质定量试剂盒，美国西格马州。
1.2仪器和设备
MS 3德国IKA 的基本涡流振荡器； DPH-9272恒温孵化器，上海仪器设备工厂； DM6B荧光显微镜，Leica （） Co.，Ltd。; Micro 17R制冷高速离心机械，德国 Co.， Co. UV-2800A UV-分光光度计，上海 Co.，Ltd。
1.3实验方法
1.3.1应变激活和样品制备
1）准备白色念珠菌悬浮液。在正常盐水中制备了白色念珠菌的悬浮液，以构建小鼠口腔念珠菌疾病模型[13]。
2）制备 ET-22活细菌的乳酸杆菌。离心10 mL过夜的培养细菌悬浮液，用PBS缓冲液洗涤3次，并悬浮在1 mL的PBS中。通过2倍稀释法稀释重悬悬浮，并通过分光光度计测量具有不同稀释时间的OD600，并通过可行的细菌计数方法测量可行细菌的数量。确定 /mL的相应OD600，并每次以OD600为标准的重悬于的溶液的浓度，并首次使用它。 ET-22的干预浓度在参考文献中的唾液链球菌K12的活细菌干预浓度[14]。
3）制备 ET-22热灭活细菌的制备。通过将其放在70°C的水浴中1小时，将浓度调整/ML活细菌热灭活，并将其存储在4°C下使用。
4）制备 ET-22分泌的乳杆菌[15]。用PBS缓冲液洗涤/毫升的活细菌，然后将它们添加到无菌水[m（虫污泥）：V（水）= 1：3]，在室温下以800 r/min搅拌2 h，然后离心（4 500） r/min，10分钟），并用0.22μm无菌过滤膜过滤上清液，然后将其存储在4°C以备后用。
1.3.2白色念珠菌芽胚胎管和菌丝体转化的确定
等分试样1 ml白色念珠菌细胞进入48孔细胞培养板（每孔2×），加入含有1 ml ET-22可行细菌（/mL）或表观遗传成分的RPMI-1640培养基，在°C下在°C下37个培养基，用于°C的37个培养基。 6小时。将1 mL的RPMI-1640培养基添加到包含白色念珠菌作为对照组的48孔细胞培养板中。使用血细胞计数板[16]计算了胚胎管的形成速率。孵育时间延长至16小时，离心后，用乳酚棉蓝色染色溶液进行染色，体积分数为50％，并通过荧光显微镜观察到菌丝体的生长状态[17]。
1.3.3测定ET-22活细菌和表观遗传成分的抗氧化能力
DPPH自由基和羟基自由基清除速率测定活性ET-22细菌和 /mL参考的表观遗传成分[18-19]。
1.3.4建立小鼠口服念珠菌病模型
1.3.4.1动物模型建设方法
参考文献[20]并进行了稍作修改以建立口服念珠菌病模型。将小鼠分为空白组（正常饮食），模型组（正常饮食 +白色白色念珠菌），实验组[活细菌组（正常饮食 +白色念珠菌 +乳杆菌 et-22活细菌），热灭菌活细菌组（正常的饮食 +白色念珠菌 +乳酸乳杆菌ET-22热灭活细菌），分泌组（正常饮食 +白色念珠菌 +乳酸乳杆菌 et-22分泌）]。每组小鼠分为2个笼子，每个笼子有5个笼子。将ET-22活细菌和表观遗传成分分别加入30 mL无菌水。细菌浓度为/mL，每12小时更换一次。实验组进行了益生菌干预18天。通过饮用水给出15 mg/mL四环素盐酸盐，并接受皮下注射泼尼松龙（100 mg/kg）。模型和实验组在16天内被白色念珠菌感染，并将浸入白色念珠菌的棉签放在舌头上15分钟。被白色念珠菌感染后，将小鼠安乐死48小时。
1.3.4.2评估口腔疾病感染程度
处死小鼠后，评估并观察到舌头病变的严重程度。根据舌头上的白色凝乳样斑块的范围和严重程度，进行了0至4的病变评分[21]。
1.3.4.3组织学评估
将小鼠的一半舌组织与多聚甲醛一起固定，体积分数为4％，持续48小时[22]。武汉塞维利亚生物技术有限公司（Ltd.
1.3.4.4确定炎症因子
1）小鼠血清样品的蛋白质水平分析。血液样本保持30分钟，然后离心（10 000 r/min，15分钟）。取上上清液，并使用上清液确定血液上清液中的IL-4，IFN-γ，IL-10。 IL-17的蛋白质水平。
2）分析小鼠舌组织样品中的蛋白质水平。取走了小鼠的剩余舌头，在存在液氮的情况下进行组织匀浆，并取上中清液以确定带有BCA蛋白定量试剂盒的总蛋白质含量，并将不同小鼠舌的总蛋白质含量均匀化。使用小鼠多细分因子测定套件确定TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-6，IL-10，IL-17和趋化因子CCL20的蛋白水平。
1.3.4.5口服微生物细菌结构
1）样品收集和总DNA提取。用无菌口腔棉签刮下小鼠口腔舌涂层的微生物，将无菌棉签头切成0.5 mL核酸保护溶液，然后将其存储在-80°C下。干冰将在低温下送往上海Meiji生物医学技术有限公司，并储存在-80℃以供稍后使用，直到进行DNA提取。根据细菌DNA试剂盒的标准程序，从口服细菌样品样品中提取DNA。测试了舌植物群的DNA样品的完整性，纯度和浓度，并将通过该测试的DNA用于随后的实验。
2）细菌的Miseq测序。使用测序方法和引物（27F 5' - 3'，1492R 5' - 3'）通过聚合酶链反应通过聚合酶链反应扩增16S rRNA V3至V4区域。使用了官方推荐的ISO-SEQ库构建方法，并使用图书馆构建试剂准备套件1.0-SPV3来完成样品标准两文图书馆（4 kb）的构建。库结构完成后，使用测序试剂DNA/套件3.0进行测序。
3）生物信息学分析。在使用QIIME分析平台对初始数据进行集成，剪接和质量控制后，获得了高质量的测序数据。对序列进行校准并与100％相似性合并，以建立一个不复制的926R→515F序列集。两步合并用于基于100％相似性合并进一步合并97％的相似性，从而建立操作分类单元（OTU）。比较了代表性的OTU序列（.8）与通过RDP和物种注释的数据库进行了比较，并比较了不同分类水平下不同组的组成和丰度分布。对样品进行主成分分析（PCA），以比较样品之间细菌结构的差异。
1.4数据处理
所有数据均表示为平均值±标准偏差。每组实验均以3个相似之处进行设置，并使用单向方差分析（ANOVA）和Prism 8软件中的测试分析实验结果。 pp
2结果和分析
2.1乳酸杆菌ET-22活细菌及其表观遗传成分对白色念珠菌芽和菌丝体生长能力的形成的影响
血细胞增生剂研究了乳酸菌ET-22活细胞乳酸杆菌及其表观遗传成分对白色念珠菌的芽尿管形成能力的影响。结果如图1所示。培养6小时后，活细菌组的发芽率，热灭活细菌组，分泌组和对照组为（13.33±2.03），（33.67±4.05），（23.17± 2.30）和（51.17±2.17±3。3.41）％。与对照组相比，ET-22活细菌和表观遗传小管的芽胚的形成能力显着降低（P [23]研究（80.70％）。这可能是由于不同菌株的念珠菌念珠菌的芽胚胎。形成管的能力是不同的。
**说数据非常重要（P
图1 ET-22活细菌及其表观遗传成分
对白色念珠菌芽尿管形成的影响
图1 Ofl.-22 Live及其在管子上
乳酸杆菌ET-22及其表观遗传成分的菌丝生长能力通过乳酸苯酚棉蓝色染色方法研究，结果如图2所示。小型萌芽状态，而ET-22死细菌组和分泌组主要由少量的菌丝体聚集组成，并且没有形成稳定的单层生物膜，而对照组则是细丝。聚集形成稳定的生物膜结构。白色念珠菌的菌丝体生长被认为是口腔念珠菌疾病的原因之一[24]。结果表明，帕拉基氏乳杆菌ET-22活细菌及其表观遗传成分对白色念珠菌菌丝体的转化具有一定的抑制作用。
图2 ET-22活细菌及其表观遗传成分
白色念珠菌菌丝体生长能力的影响
图2 ofl.-22 Live及其上
2.2分析乳杆菌的抗氧化能力ET-22活细菌及其表观遗传成分
帕拉基氏菌ET-22及其表观遗传成分的抗氧化能力如图3所示。从图3中可以看出，可以看出，帕拉西氏乳杆菌ET-22活细菌及其表观遗传成分具有消除DPPH和DPPH和羟基自由基的能力。消除能力是完全不同的。 ET-22中活细菌DPPH的清除显着高于热灭活细菌和分泌物的清除（P [25]。ET-22中热灭活细菌的羟基自由基的清除率显着高于活体活化细菌ET-22和分泌物中的细菌（P [19]。结果表明，乳酸乳杆菌ET-22的细菌表面，细胞内成分和细胞外分泌物含有消除DPPH和羟基自由基的更多活性物质。
**说数据非常重要（P
图3乳酸杆菌的抗氧化能力ET-22活细菌及其表观遗传成分
图3 ofl.-22 Live及其
2.3分析白色念珠菌诱导的小鼠的舌组织损伤
每组舌头的组织状态如图4所示。从图4中，空白组的舌头表面光滑而圆形，呈浅粉红色，显示出正常的形状。模型组舌头中厚的白色斑纹假单胞膜的覆盖范围大于91％，舌头根部的厚白色斑纹假单胞菌很明显，并且有轻微的下降现象。 ET-22活细菌组的舌头上的白色斑点是点形的，覆盖率小于20％，并且略微扩大。 ET-22热灭活细菌组和分泌组的舌头是不同程度的白色斑块。与空白组相比，模型组的舌头，热灭活的细菌组和分泌组显示出明显的扩大。每组舌组织病变的病变如图5所示。从图5中，模型组的损伤评分和三个实验组（活细菌，热灭活细菌和分泌物）为（3.10±0.88），（ 1.67±0.87），（2.60±1.17）和（2.11±0.93）点。与模型组的损伤评分相比，所有益生菌干预组的损伤得分均显示下降趋势，与模型组相比，ET-22热灭活的细菌组和分泌组分别降低了16.13％和31.94％。 ;其中，ET- 22个活细菌组的损伤得分显着降低了46.13％（P
图4白色念珠菌诱导的小鼠舌头的代表性病变分析
鼠标的图4
*重大数据差异（P
图5白色念珠菌诱导的舌组织病变的评分
鼠标的图5
2.4白色念珠菌诱导的小鼠中舌组织状态的分析
组织学用于分析小鼠的舌组织状态，结果如图6所示。空白组中的小鼠显示出正常的舌组织，而模型组中的小鼠显示出各种上皮病变，例如乳头状脱硫，上皮松弛，组织增生，上皮内微舒张和强烈的炎症性浸润。 ET-22活细菌干预后，舌结构的棘突松散和炎症浸润均减少了，上皮组织的保留程度与空白组相似。除了在ET22热灭活细菌组中略微缓解乳头缺失和上皮脱象病变外，ET-22热灭活细菌组略有缓解。 ，其余的病变和炎症浸润基本与模型组相同。在ET-22分泌的干预后，舌组织中的偶发性解剂损伤消失了，炎症性浸润减少了。结果表明，乳酸杆菌ET-22活细菌及其表观遗传成分可以在不同程度上减轻口服念珠菌病的病变。该结果与乳酸乳杆菌28.4在小鼠中缓解口服念珠菌的结果一致[22]。
黑色圆圈是上皮细胞在舌头背面的乳头状突出，红色圆圈是组织增生，黑箭头是炎症细胞的浸润部位，红色箭头是上皮脱落和受损的部位。
图6白色念珠菌诱导的舌头病变的组织学评估
鼠标的图6
2.5白色念珠菌诱导的小鼠舌中细胞因子和趋化因子的含量变化
小鼠多因子检测试剂盒用于测量小鼠舌组织中细胞因子和趋化因子的含量，结果在图7中显示了与模型组相比，在ET-22 Live细菌及其表观遗传成分之后，结果与模型组相比。 ，促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的含量显示出向下趋势，其中在ET-22分泌干预后研究了IFN-γ和TNF。 -α含量极大地降低（PP [26]。与模型组和空白组相比，益生菌组的细胞因子IL-10和IL-6含量没有显着差异。细胞膜中的某些蛋白质白色念珠菌有效地诱导CD4+ T细胞分化为产生IL-17a的Th17细胞，进而诱导EGFR和EPHA2磷酸化，从而诱导上皮细胞分泌趋化因子CCL20以刺激巨噬细胞迁移到病变位置[27-28]。与模型组相比，-22分泌组中趋化因子CCL20的含量没有显着差异，这可能是由于上游IL-17a的含量较低。可行的细菌组和热灭活细菌组高于模型中的趋化因子含量。
*，＃表示空白组和模型组之间的显着差异（PP
图7小鼠舌组织中白色念珠菌诱导的细胞因子和趋化因子的变化
图7和鼠标
2.6白色念珠菌诱导的小鼠血清细胞因子含量的变化
小鼠多细分因子检测试剂盒用于测量小鼠细胞因子的含量，结果如图8所示。与模型组相比，IFN-γ，IL-10和IL-17a的含量显示出在后下向下趋势。益生菌干预，IFN-γ的含量显着降低（PP
*，＃表示空白组和模型组之间的显着差异（PP
图8小鼠血清中白色念珠菌诱导的细胞因子的变化
小鼠血清中的图8
2.7分析小鼠舌涂层表面应变的变化
16S rDNA用于分析小鼠舌涂层的表面菌株，结果如图9所示。比色表的颜色梯度显示了样品中不同物种的丰度变化。可以得出结论，模型组中的肠杆菌科，肠杆菌和蛋白质细菌的丰度显着高于空白组。在ET-22热灭活细菌组中，与模型组相比，肠杆菌和肠杆菌科的水平显着增加。在ET-22可行细菌组中，它显着降低。该研究发现，肠杆菌科的丰度增加与口服念珠菌病的发生有关，例如，肠杆菌科的丰度增加与复发性放腹膜炎的患者的溃疡发生呈正相关[29]。
图9小鼠的真菌组成水平和属水平
图9小鼠的属和属水平
与空白组相比，模型组中细菌植物家族的相对丰度（菌叶植物）和细菌群，ET-22活细菌和分泌组的相对丰度显着增加。该研究发现，复发性放置炎的患者的粘膜菌群中菌孢菌的丰度显着高于健康人[30]。结果表明， et-22活细菌组具有调节由口服念珠菌引起的菌落变化的能力。
PCA分析是基于Bray-at-aT域和属水平进行的，结果如图10所示。空白组的家族水平和ET-22可行细菌组在PC1（36.91％）轴上[图[图10（a）]，属水平在PC2（31.43％）轴上[图10（b）]，该轴与模型组存在。显着分开。 ET-22分泌组在家族和属水平的组成与模型组完全重叠。结果表明，口服念珠菌和健康小鼠的结构组成存在显着差异。 ET-22活细菌可以通过改善模型组的舌头菌群的结构来预防口服念珠菌病。
图10分析具有水平和属水平的小鼠的主要成分
图10小鼠和属水平的PCA
与空白组相比，在各种水平上的群体间差异分析的结果显示，模型组中蛋白质精神分裂症，芽孢杆菌，盲肠和肠球菌的相对丰度显着增加了相对丰度的相对丰度。 ET-22热灭活的细菌显着增加了克雷伯菌的相对丰度。乳酸乳酸可以通过分泌天然抗菌剂链球菌链球菌素来抑制白色念珠菌菌丝体的转化和生物膜的形成[31]；龋齿和牙周炎症和其他口腔疾病的蛋白质，和肠球菌的检测率和丰度明显高于健康人[32-33]。该研究发现，牙周炎患者的副细菌种群中克雷伯菌的丰度显着增加，而肠球菌和念珠菌的丰度高于健康人[34]。结果表明，ET-22活细菌可以通过定植小鼠舌涂层的表面来减少致病细菌的丰度，而ET-22热灭活细菌可以通过增加丰富的有益细菌来调节小鼠舌涂层。
图11小鼠舌涂层中微生物水平的差异分析
鼠标的图11
3结论
在体外共培养系统中，ET-22活细菌及其每种细菌的表观遗传成分可以降低白色念珠菌的发芽率和菌丝体转化能力，从而降低念珠菌白色念珠菌的感染能力，其中ET -22活细菌的最佳抑制作用。在体外抗氧化剂的结果中，ET22活细菌的DPPH自由基清除能力具有最强的羟基自由基清除能力的能力。
动物模型研究的结果表明， ET-22活细菌，热灭活细菌及其分泌可以通过抑制白色念珠菌，尤其是最有效的ET-22活细菌来预防口服念珠菌病。好的。 ET-22可行的细菌显着降低了念珠菌诱导的小鼠舌组织中IFN-γ和TNF-α的含量，并增加了趋化因子CCL20的含量，同时还调节了小鼠和丰富性的舌群的多样性，这可以减少舌组织和粘膜组织损伤的炎症性浸润。 ET-22热灭活细菌和分泌物在抑制白色念珠菌和预防口服念珠菌病方面也具有一定的积极作用。 ET-22热量灭活细菌主要是通过增加趋化因子CCL20的含量并调节小鼠舌植物菌群的变化，而ET-22分泌主要减少舌体组织中的促炎性因子IFN-γ和小鼠的血液。它具有某些预防作用和TNF-α含量。当前，口腔健康中使用的功能性食品仍处于开发阶段。作为出色的口服益生菌菌株，乳酸杆菌ET-22将来可以研究其活细菌和表演成分的功能研究，以开发特定的功能性食品成分或开发功能性食品以预防口腔疾病以预防口腔疾病，从而奠定了一定的理论基础。
参考：省略
引用格式：Zhao Zhi，Sun Zhe，Liu 等。乳杆菌ET-22及其表观遗传成分对白色念珠菌的抑制作用[J]。食品科学技术杂志，2024，42（1）：94-105。，Sun Zhe，Liu等。 ET-22及其在[J]上。 of Food and , 2024,42(1):94-105.
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