生物膜是附着于物体外部或与另一物体接触表面的结构化的微生物群落[1]，由微生物及其分泌的胞外基质组成，为适应生存环境而在活性或惰性物质的外层形成[2]。在水环境中，生物膜存在于大多数固体附着基质表面。细菌附着于基质表面并产生胞外产物形成生物膜，是生物膜形成的重要环节[3]。影响生物膜形成的因素很多，如温度和盐度[4]、培养基中的营养物质[5]、不同类型的细菌[6]等。生物膜可影响贻贝、藤壶等幼体附着和变态[7-9]，该现象是海洋经济贝类养殖和海洋防污研究的热点。
钙离子是一种高度通用的细胞内信号，能够调节许多不同细胞的功能[10]。在海洋环境中，钙是一种经常在物体表面富集的元素，要么以沉积的钙沉积物形式存在，要么与其他海洋生物伴生[11]。钙能够影响生物膜的形成，尤其是钙参与细胞与基质之间的特异性和非特异性相互作用[12-13]。实验表明，钙离子可以促进大肠杆菌生物膜和铜绿假单胞菌生物膜的形成[14-15]，并抑制霍乱弧菌生物膜的形成[16]。
钙离子如何影响海洋细菌生物膜的形成？是否影响生物膜对海洋无脊椎动物附着的调控？为了解释上述问题，本试验以典型的大型污损生物厚壳贻贝为研究对象，利用不同钙离子浓度的人工海水（ASW）培养生物膜，观察生物膜密度、膜厚度及稚贝附着率的变化，并利用共聚焦显微镜技术分析不同钙离子浓度影响下生物膜的胞外多糖、胞外脂质和胞外蛋白。旨在明确钙离子浓度对生物膜形成的影响及其在海洋无脊椎动物附着过程中的作用，为海洋污损生物的防治提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料
试验所用的海洋假交替单胞菌（ ）为上海海洋大学贝类分子生物学实验室（以下简称本实验室）保藏菌株（保藏编号为MCCC），该菌株来源于浙江省嵊泗县枸杞岛（122°46′E，30°43′N）的天然生物膜表面，经2216E平板划线培养，分离获得单株菌，用甘油-盐水保藏液保存，-80 ℃超低温冰箱保存。
天然海水（NSW）取自浙江省嵊泗县枸杞岛附近，测定钙离子浓度为11.78 mmol/L。考虑到需要调节海水中钙离子含量，而利用天然海水无法降低钙离子含量。因此本试验制备与天然海水成分最相似的人工海水（ASW），以达到人为调控海水钙离子浓度的目的。试验设立钙离子浓度为10 mmol/L的对照组，以及钙离子浓度为0、1、5、20、50 mmol/L的5个实验组。人工海水配方为：蒸馏水、NaCl、MgSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、KCl、CaCl2、NaNO3、K3PO4、β-五水甘油磷酸二钠、·9H2O、维生素、pⅡ、、Tris、氨基三乙酸。
试验所用的厚壳贻贝稚贝采自浙江省舟山市嵊泗县（122°46′E，30°69′N），在本实验室天然海水中临时培养1周后使用，选取壳长为（0.56±0.03）mm、壳高为（0.38±0.02）mm的稚贝进行附着试验。
实验所用的激光共聚焦显微镜为Leica公司产品(×630)。
1.2 方法
1.2.1 海洋假交替单胞菌的分离参照杨等[17]的方法，将附着在载玻片上的天然生物膜（浙江省嵊泗县枸杞岛）从载玻片表面刮入滤过的海水中，将混有菌液的海水均匀铺在2216E平板上，倒置平板，在25 ℃暗处培养48 h，从中挑取目标菌落。对筛选出的菌株再进行反复分离纯化，最终得到证实的海洋假交替单胞菌纯菌株（经Adapt Noise分析，上海美吉生物制药技术有限公司），用0.9%生理盐水配制成30%甘油种子液，后置于-80 ℃超低温冰箱中保存。
1.2.2 生物膜的制备参照杨等[17]的方法，将海洋假交替单胞菌纯株培养于2216E液体培养基中，25 ℃避光培养16 h。培养后的菌液用无菌海水洗涤3次，最后固定为50 mL悬浮菌液。用BX-51荧光显微镜测定菌液的细胞密度并将相应的菌液加入培养皿（直径64 mm×19 mm）中，加无菌海水使培养皿最终体积为20 mL。18 ℃避光培养48 h，形成实验生物膜。
菌液初始细胞密度分别设定为1×106、1×107、1×108、5×108个/mL，以这4个密度进行天然海水（NSW）与人工海水（ASW）生物膜形成对比试验，其余试验选定最佳密度为1×108个/mL。
1.2.3 生物膜细菌密度计算参照杨等[17]的方法，将用5%甲醛溶液固定的生物膜用0.1%吖啶橙溶液染色5 min，烘干切片，在1000倍荧光显微镜（BX-51）下选取30个区域计数细菌数量，计算公式为：
生物膜细胞密度（个/cm2）=该区域细菌数（个）/（该区域数量×该区域面积10-4 cm2）。
1.2.4 厚壳贻贝稚贝附着试验将含有生物膜的玻璃片置于培养皿中，加入20 mL灭菌海水，放入10只稚贝，每组重复9次，在18 ℃黑暗环境下培养，根据稚贝放入的时间分别观察12、24、48 h的附着情况，计算附着率（%）。
附着率=载玻片上附着贝壳数/幼贝壳总数×100%。
由于12、24、48 h的粘附率结果基本相似，因此本试验仅展示24 h的粘附率结果。
1.2.5 共聚焦激光扫描显微镜标本染色 共聚焦激光扫描显微镜标本染色采用表1所列染料，在暗处进行，参照González等[18]的方法，染色20 min。染色前后用0.9%生理盐水冲洗生物膜，计算生物量体积(μm3)，即
生物量体积=生物量总面积（经Image J软件处理）×切片厚度0.2μm。
1.3 数据处理
所有数据采用JMP 10.0.0软件进行统计学分析和相关性检验。统计分析前，所有数据均进行正态性检验，符合正态分布的采用单因素方差分析。采用多变量分析验证稚贝附着率、钙离子浓度与细菌密度、膜厚度、胞外产物生物量之间是否存在相关性，显著性水平为0.05。采用Image J软件对共聚焦图像进行处理，计算胞外产物的共聚焦面积。
2 结果与分析 2.1 天然海水与人工海水中形成的生物膜细菌密度及稚贝附着率
从图1A中可以看出：当初始菌液浓度为1×106 cells/mL时，天然海水形成的生物膜的细菌密度为1.24×106 cells/cm2，人工海水形成的生物膜的细菌密度为1.19×106 cells/cm2，二者无显著差异（P>0.05）；随着初始菌液密度的增加，天然海水和人工海水中培养的生物膜的最终细菌密度均呈现显著增加的趋势（PP>0.05）。
表1 激光共聚焦显微镜标本染料成分及染色对象
表 1 染料和激光
染料染色靶浓度激光波长/检测波长/碘化丙啶（PI）死菌5μg/～700四甲基罗丹明结合物刀豆球蛋白A，（ConA-TMR）α多糖944.8μg/～700 荧光增白剂M2R白色M2R（CFW）β多糖189μL/～5601,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰基高氯酸酯（5）油，1,1'--3,3,3',3'---（DiD'oil）脂质7.94μL/～700异硫氰酸荧光素I（FITC）蛋白质46.6μg/～700
的均值在0.05水平上在内，而的均值不在内，等。
图1 天然海水与人工海水生物膜上细菌密度及幼贝附着率
图1 和速率
从图1B中可以看出，当初始菌液密度为1×106和1×107 cells/mL时，加入稚贝24 h后，天然海水和人工海水生物膜诱导的厚壳贻贝稚贝附着率（13.33%）与空白组稚贝附着率相比差异不显著（P>0.05）；当初始菌液浓度为1×108 cells/mL时，天然海水生物膜中稚贝附着率为35.56%，人工海水生物膜中稚贝附着率为36.67%，均显著高于前两个初始密度组（PP>0.05）；初始菌液密度为5×108 cells/mL时，天然海水组与人工海水组稚贝附着率差异不显著（P>0.05），与1×108 cells/mL密度组相比差异不显著（P>0.05）。
2.2 不同钙离子浓度下生物膜细菌密度
如图2所示，当人工海水形成的生物膜初始密度为1×108个/mL时，钙离子浓度为10 mmol/L时假交替单胞菌生物膜的最终密度最高，为2.53×107个/cm2；当钙离子浓度增加或降低时，生物膜的最终密度均呈现明显的下降趋势（P7个/cm2）。
图2 钙离子浓度对生物膜细菌密度的影响
图2 细胞
2.3 不同钙离子浓度下稚贝生物膜附着率
从图3可以看出，当菌液初始密度为1×108 cells/mL时，在钙离子浓度为0和1 mmol/L条件下，添加稚贝幼贝24 h后在人工海水中的附着率为22.22%，与空白对照差异不显著（P>0.05）。随着钙离子浓度的升高，稚贝幼贝附着率也呈现上升趋势，在钙离子浓度为10 mmol/L时达到最大值（35.56%），随后开始下降，当钙离子浓度为50 mmol/L时，稚贝幼贝附着率仅为23.33%。
图3 钙离子浓度对生物膜诱导幼体附着的影响
图3
2.4 不同钙离子浓度下生物膜形态和厚度
利用共聚焦显微镜观察了不同钙离子浓度下培养48 h的海洋假交替单胞菌生物膜上细菌的分布形态（图4A）。当钙离子浓度为0 mmol/L时，细菌分布最稀疏，膜厚度也相对较薄，仅为4.00 μm。当钙离子浓度升高至10 mmol/L时，细菌开始聚集，细菌密度逐渐增加，此时膜厚度达到最大值5.62 μm。当钙离子浓度升高至50 mmol/L时，细菌数量逐渐减少，呈稀疏状态，生物膜厚度呈现明显的下降趋势（P2.5不同钙离子浓度对生物膜中胞外多糖的影响
利用共聚焦显微镜观察不同钙离子浓度下培养48 h的生物膜胞外多糖(图5A、图6A)。当钙离子浓度为0 mmol/L时，假交替单胞菌生物膜胞外α-多糖和β-多糖生物量最低，分别为32.28和34.55 μm3。当钙离子浓度为10 mmol/L时，胞外多糖生物量增至最大值，胞外α-多糖生物量为258.35 μm3，胞外β-多糖生物量为174.74 μm3。随着钙离子浓度的继续升高，生物膜胞外多糖生物量呈现明显的下降趋势(P
图4 共聚焦显微镜下不同钙离子浓度下的生物膜形貌及厚度
图4 激光与下
图5 不同钙离子浓度下胞外α-多糖及其生物量的共聚焦激光图像
图5 激光与α-
2.6 不同钙离子浓度对生物膜中细胞外蛋白的影响
利用共聚焦显微镜观察不同钙离子浓度下培养48 h的生物膜胞外蛋白（图7A）。钙离子浓度为0 mmol/L时假交替单胞菌生物膜胞外蛋白生物量最低，为117.47 μm3。钙离子浓度为10 mmol/L时，胞外蛋白生物量升高至最大值，为334.15 μm3。随着钙离子浓度的继续升高，生物膜中胞外蛋白生物量呈现明显的下降趋势（PP>0.05）（图7B）。
图6 不同钙离子浓度下胞外β-多糖及其生物量的共聚焦激光图像
图6 激光与β-
图7 不同钙离子浓度下胞外蛋白及其生物量的共聚焦激光图像
图7 激光及下方
2.7 不同钙离子浓度对生物膜胞外脂质的影响
利用共聚焦显微镜观察不同钙离子浓度下培养48 h的生物膜胞外脂质（图8A），假交替单胞菌生物膜胞外脂质生物量在钙离子浓度为0 mmol/L时最低，仅为11.52 μm3，在钙离子浓度为10 mmol/L时，胞外脂质生物量升高至最大值，为22.02 μm3，随着钙离子浓度的继续升高，生物膜胞外脂质生物量呈现明显的下降趋势（PP>0.05）（图8B）。
图8 不同钙离子浓度下细胞外脂质及其生物量的共聚焦激光图像
图8 激光与脂质
2.8 相关性分析
从表2可以看出，稚贝附着率与生物膜的细菌密度、膜厚度、胞外多糖、胞外蛋白含量呈显著相关性（PPP>0.05）。
3 讨论
低钙离子浓度可以显著诱导莫桑比克罗非鱼黏液细胞增殖以抵抗外界胁迫[19]，同时钙离子浓度可以显著影响三角帆蚌的生长[20]，但目前尚未有试验验证钙离子浓度对假交替单胞菌生物膜及厚壳贻贝稚贝附着的影响。
表2 生物膜生物学特性与稚贝附着率及钙离子浓度的相关性分析
表2 其中， 和 的比例
生物学特性 幼虫附着率 相关系数rP值 钙离子浓度 相关系数rP值 生物膜密度.338 80.012 2*0.099 70.182 8 生物膜厚度.366 50.006 4*0.483 30.000 2*胞外α-多糖α-.354 30.00 86*0.265 40.052 4 胞外β-多糖β-.354 30.008 6*0.050 40.717 2 胞外蛋白质.320 40.018 2*0.263 30.054 4 胞外脂质.202 20.142 60.064 40.643 9
注：*表示显著相关（P
注：*表示(P
3.1 天然海水与人工海水对比
由于本试验要研究钙离子浓度变化对假交替单胞菌生物膜及稚贝附着的影响，需要调节钙离子浓度，因此采用人工海水来调节钙离子浓度。与天然海水相比，本试验所用的人工海水在4种不同的初始菌液密度下对假交替单胞菌生物膜的形成均无显著影响。4种不同的初始菌液密度下，人工海水中培养的细菌生物膜与天然海水中培养的生物膜的细菌密度无显著差异，两种海水中培养的细菌生物膜对稚贝附着的诱导活性亦无显著差异，重复试验得到的结果均一致，说明人工海水对于细菌生物膜的形成具有较强的稳定性。说明本试验可以使用人工海水来替代天然海水。另一方面，人类活动会造成海水中氮、磷、石油类物质超标等污染问题[21]。海水污染影响海水养殖的质量和效益，而海洋环境污染会导致养殖品种质量下降。因此，未来可以考虑用人工海水替代天然海水进行陆地人工养殖。
3.2 不同钙离子浓度对生物膜形成的影响
通过实验可以观察到，当钙离子浓度为10 mmol/L时生物膜细菌密度及生物膜厚度达到最大值，其他钙离子浓度下均降低。共聚焦显微镜观察结果表明，当钙离子浓度为10 mmol/L时生物膜中细菌聚集，在其他钙离子浓度下细菌分散且密度降低，生物膜形成能力变差。对假交替单胞菌（ sp.）的研究也有类似的结果，当钙离子浓度为10 mmol/L时，该菌生物膜最厚，其他浓度下生物膜厚度均降低[11]。实验结果与本实验结果一致。
本研究经相关性分析发现，钙离子浓度仅与生物膜厚度显著相关，而生物膜厚度受胞外产物生物量的影响。生物膜形成是一个连续的过程，浮游细菌附着于生物膜表面，进而形成生物膜，生物膜中的细菌被嵌入由核酸、蛋白质和多糖组成的基质中[22-24]。在生物膜中生长的细菌会产生一种或多种胞外产物，这些胞外产物作为支架将生物膜群落中的细菌维系在一起；多糖是生物膜基质的主要成分，对生物膜的整体结构和抵抗力有贡献[23,25-26]。钙离子对微生物各方面的影响最终体现在生物膜及其胞外产物的变化上[27]。本实验对培养48小时的胞外产物进行共聚焦显微镜拍照，以验证钙离子是否也对胞外产物产生影响。生物膜的胞外产物主要有3种：多糖、脂质和蛋白质，其中多糖和蛋白质占主导地位。当钙离子浓度为10 mmol/L时，海洋假交替单胞菌生物膜的胞外产物最多，而在其他浓度下，胞外产物减少。这些实验结果可以证实钙离子浓度过高或过低都会影响生物膜的形成。
3.3 不同钙离子浓度培养的生物膜对厚壳贻贝幼苗附着的影响
许多海洋无脊椎动物幼体沉降变态会受到生物膜的影响[7]。皱菌和半透明菌两种突变体形成的假交替单胞菌生物膜显著降低了诱导厚壳贻贝幼体沉降变态的活性，表明其具有较强的抗污能力[28]。本试验中，除钙离子浓度为10 mmol/L外，在其他钙离子浓度下培养的海洋假交替单胞菌生物膜均对厚壳贻贝幼体沉降有抑制作用，即提高或降低钙离子浓度，形成的生物膜均可降低幼体沉降。
相关性分析显示，稚贝附着率与生物膜密度、膜厚度、胞外多糖和胞外蛋白质显著相关。参考Yang等[17]的方法，希瓦氏菌促进厚壳贻贝幼体附着变态，可能与其释放的信号分子和胞外产物有关。胞外产物主要为多糖、蛋白质、核酸和脂质，它们提供生物膜的机械稳定性，介导与表面的黏附，并形成有黏聚力的三维聚合物网络[29]。除10 mmol/L钙离子浓度外，生物膜胞外产物在所有浓度下均减少，这与稚贝附着率的变化趋势一致。胞外产物的减少与稚贝附着率的降低相关。
对sp.的研究发现，10 mmol/L钙离子浓度导致鞭毛蛋白表达减少、外膜蛋白表达增加，形成生物膜的能力增强[11]。大肠杆菌的外膜蛋白OmpA已被证实能与非生物表面结合，并在非生物表面生物膜的形成中发挥作用[30]。大肠杆菌ompA基因缺失的突变菌形成的生物膜厚度大大降低[31]。结合本实验结果，推测钙离子可能影响海洋假单胞菌外膜蛋白的表达，从而抑制胞外产物的分泌，从而影响生物膜的形成和幼贝的附着。
4 结论
1）当钙离子浓度高于或低于10 mmol/L（最接近自然海水的浓度）时，假交替单胞菌海洋生物膜的形成受到抑制。
2）钙离子浓度过高或过低，均抑制生物膜密度和膜厚度的形成，以及胞外多糖和胞外蛋白的分泌，从而抑制厚壳贻贝稚贝的附着。
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