海藻糖-6-磷酸合酶（-6--，TPS）试剂盒说明书 分光光度法 50管/48个样本 在正式测定前，务必取2-3个预期差异较大的样本进行预测定。 测定意义： 海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α，α-1-1糖苷键连接而成的非还原性二糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、无脊椎动物和高等植物中。海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等很稳定，加之它有很强的吸水能力，使得它在体内具有抗脱水作用，在逆境条件下通过识别外界刺激、产生和传递信号、基因表达和代谢调控等方式保护植物免受不良环境的伤害。
海藻糖在植物中主要以葡萄糖为底物合成，反应始于海藻糖-6-磷酸合成酶。
（-6-，TPS），催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和6-
葡萄糖磷酸反应生成中间产物海藻糖-6-磷酸，海藻糖-6-磷酸再与海藻糖-6-磷酸磷酸酶（
6-，TPP）生成海藻糖。因此，测定TPS活性对于研究植物逆境具有重要意义。测定原理：TPS催化UDPG和G6P生成海藻糖-6-磷酸，同时生成UDP；UDP在丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶作用下，将NADH氧化为NAD+，NADH的减少速度与UDP含量成正比。340nm处吸光度的减少速度反映TPS的活性。需准备的仪器及用品：分光光度计、水浴锅、可调移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂组成及配制：提取液：100mL液体×1瓶，4℃保存；
试剂1：粉末×1瓶，-20℃保存；使用前加入试剂5 10mL溶解，剩余试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂2：粉末×2瓶，-20℃保存；使用前每瓶加入25mL试剂5溶解；立即配制使用；
试剂3：粉末×1瓶，-20℃避光保存；使用前加入试剂5 0.1mL溶解，将剩余试剂分装成
-20℃保存，不可反复冻融；
试剂4：100μL×1瓶，4℃避光保存；使用前请低速离心，防止试剂粘附管壁；试剂5：液体100mL×1瓶，4℃避光保存；
工作液配制：使用前先配制试剂2和试剂3，然后取一瓶试剂2，加入25μL试剂3和25μL试剂4，充分混匀，立即使用。样品测定的准备：1.细菌或细胞的处理：将细菌或细胞收集到离心管中，离心后弃上清液；根据细菌或细胞的数量
（104）：提取液体积（mL）为500~1000：1（建议1mL提取液加入500万个细菌或细胞），超声破菌（冰浴，功率20%或200W，超声3S，间隔10S，重复30次）；8000g、4℃离心10min，取上清，置于冰上待测。
2. 组织处理：按组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），冰浴匀浆，8000g、4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
1. 将以下试剂加入EP管中
试剂名称 (μL)
测定管
样本
150
试剂 1
150
混匀，30℃反应20min，95℃水浴2min灭活，冷却至室温，4℃离心5min，取上层反应液供测。
2、工作液的配制：详见试剂组成与配制。
3. 将以下试剂加入1mL玻璃比色皿中：
反应溶液
100
工作流体
900
混匀，在340nm处测定5分钟后吸光度值A1，10分钟后吸光度值A2，ΔA=A1-A2。
TPS活性计算：1.根据蛋白质浓度计算
单位定义：1单位酶活力定义为每分钟1mg组织蛋白催化的NADH的量。
TPS 活性 (nmol/min/mg 蛋白质) = ΔA × V 总 ÷ (ε × d) × 109 ÷ (V 样品 × Cpr) ÷ T × 3
=643×ΔA÷Cpr
2.按样品鲜重计算
单位定义：1单位酶活力定义为每克组织每分钟催化的NADH的量。
TPS活性（nmol/min/g鲜重）=ΔA×V总÷（ε×d）×109÷（W×V样÷V总）÷T×3
=643×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞密度计算
单位定义：1单位酶活定义为每10000个细菌或细胞每分钟催化。
TPS 活性 (nmol/min/104 细胞) = ΔA × V 总 ÷ (ε × d) × 109 ÷ (V 样本 × 细胞数) ÷ T × 3
=1.28×ΔA
：反应体系总体积，1 mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光程，1 cm；：加入的样品体积，0.15 mL；：加入的提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；3，稀释倍数；Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量；细胞数，500万。