中药分子鉴定
第一节 中药分子鉴定概述
一、中药鉴别方法概述
中医药是中华民族长期与疾病斗争的经验总结和宝贵财富。它是中医药预防和治疗疾病的物质基础。准确鉴别中药真伪是保证药品质量和疗效的前提。在与疾病作斗争的过程中，我国人民通过不断的尝试，逐渐积累了丰富的医学知识和经验，学会了利用眼、耳、鼻、舌等人类感官来识别植物、动物和矿物质的形态。自然。 、色、香、味，从而辨别哪些是可以药用的，哪些对人体有毒等，从而形成对“药”的感性认识。这种认识不仅促进了中医药的产生和发展，也促进了中医药事业的发展。中药鉴定知识随之产生和发展。 1934年，赵璜黄、徐伯勋等人编着的我国第一部《生药学》介绍了现代中药鉴定的理论和方法。此后，随着中药鉴别祖先的不断完善和发展，逐渐形成了中药鉴别的四种基本方法，即中药基本鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别。
(一)中药传统鉴别方法
1、产地鉴定是根据形态特征，运用动植物分类学方法，确定药材来源的动植物种类，确保药材来源准确。主要包括本草考证、动植物研究、标本形态研究三个方面。它本质上是以药用动植物形态学的分类和鉴定为基础的。药用动植物基地鉴定已成为中药鉴定最基本、最可靠的鉴定方法。基因组鉴定直观、快速、实用，但需要一定的分类学基础，没有动植物分类经验的人很难掌握和利用。
2、性状鉴别，即感官评价，是对形状、大小、重量、颜色、表面特征、断口表面纹理、气味、粘度、酸度等进行评价，对碱度等进行鉴别和描述，只有经验丰富的专业人员才能进行更准确的评估，也称为经验识别。其优点是直观、快速、实用，并具有一定的准确性。至今仍是鉴定中药材的常用方法，是现行《中国药典》的重要评价依据。感官评价的缺点是只能提供定性描述，主观性强。同时，在多源药材、破碎药材、粉状药材和中成药的鉴定方面也存在一定的局限性。
3、显微鉴别？是指用显微镜鉴别药材、片、片、粉、游离组织或表层片、含片粉制剂的组织、细胞或内容物的特征。主要包括组织鉴定和粉末鉴定。组织鉴定是通过观察切片、粉碎切片来鉴定药材的组织结构特征，适用于完整药材或同属药材粉末特征相似的鉴定；粉末鉴别是通过观察粉末切片或离解片来鉴定药材的细胞分子。及包裹体的特征，适用于破碎、粉状药材或中成药的鉴别。 1951年，徐国俊院士出版了101种药材的《粉末生药检索表》，开创了粉末鉴别的先河。此后，他发表了《中药粉末的显微鉴别》，填补了我国中药粉末研究的空白，使我国粉末生药的显微鉴别达到了国际先进水平。到1977年版《中国药典》开始收载显微鉴别，显微鉴别已成为中药鉴别的重要方法。由于组织特征的相似性，显微解剖特征很难解决密切相关的药材的鉴定问题。同时，组织结构易受地理环境、生长期、储存条件等诸多因素的影响，从而影响鉴定的准确性。
4、理化鉴定？它是20世纪发展起来的一项识别技术。它采用化学或物理方法，对中药中所含的有效成分或特征成分进行定性、定量分析，以鉴定中药的真伪、纯度和质量。识别方法。随着色谱技术、光谱技术、色谱-光谱技术在中药分析中的应用，中药理化鉴定体系逐渐形成和成熟。理化鉴定对中药标准化发挥着巨大的推动作用。但由于大多数中药有效成分不明确且不是单一成分，变异较大，且其含量受采收时间等多种因素影响，因此难以设定合理的数值。标准，因此《中国药典》中仍有不少药材没有定量指标或理化鉴别指标。
上述四大方法在中药鉴定过程中始终发挥着主导作用。但一些疑难药材的鉴定还存在困难，如关系密切的药材、名贵药材、动物药材等，鉴定时仍需准确、客观。进一步提高。
(2)中药分子鉴定方法
中药分子鉴定是利用中药中大分子信息对中药进行鉴定的方法。中药中的大分子包括DNA、RNA和蛋白质。由于中药样品的特殊性，目前中药分子鉴定主要集中在DNA分子鉴定上。 DNA作为遗传信息的直接载体，具有信息量大、遗传稳定性高、化学稳定性强等特点。物种之间的差异归根结底是由于DNA核酸序列的不同。通过直接分析不同中药品种的基因组成，可以实现中药的DNA分子鉴定。因此，利用DNA分子特征作为遗传标记来鉴定中药更加准确可靠。
中药分子鉴定不仅用于鉴定不同品种的中药，还广泛应用于不同人群、不同种质资源和地道药材的研究，为中药鉴定提供遗传证据；特别是在珍稀药材、动物物种鉴定、药材鉴定、珍稀濒危动植物、可提取DNA的中药及其制剂等方面具有独特的优势。
随着技术的发展和成熟，中药分子鉴定已进入实用阶段。 2010年版《中国药典》首次收载了蛇纹石和日本神猿饮片的特异性PCR鉴定方法，成为全球首个中药和天然药物分子鉴定国家标准。 2012年和2014年颁布的《中国药典》增补还收载了贝母PCR-RFLP鉴定方法和中药材DNA条形码分子鉴定方法的指导原则。
中药分子鉴定主要分为基于分子杂交的鉴定技术、基于PCR扩增的鉴定技术和基于DNA序列分析的鉴定技术。
1、基于分子杂交的鉴定技术？包括RFLP和DNA芯片等。以RFLP为例，不同药材样品的基因组DNA在限制性酶的作用下，在特定的核苷酸序列处被切割，产生不同长度的DNA片段。不同来源的药材DNA酶切位点的差异，导致酶切后的DNA片段长度发生变化，导致某一位点的DNA片段用克隆探针进行电泳检测时，电泳条带位置不同，可用于鉴别和鉴别药材真伪。 20世纪90年代末，该方法首先用于基生植物珊瑚属不同居群的鉴定，随后应用于柴胡属、羽扇豆属、甘草属和白术属等类群的鉴定中，研究发现利用RFLP构建的系统发育关系与这些植物的形态、细胞学或化学成分含量具有一定的相关性。
2、基于PCR扩增的鉴定技术？包括RAPD、ISSR、SSR、特异性PCR等。以特异性PCR鉴定方法为例。该方法是以道地药材及饮片中特定的DNA片段或碱基为基础设计的寡核苷酸序列作为引物，采用PCR技术对基因组DNA模板进行扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离并用核酸染料染色后，根据条带的大小和有无来鉴定药材的真伪。继1997年采用特异性PCR鉴定方法区分西洋参、人参、竹参后，利用该方法成功鉴定了一系列药材，如金银花、藏红花、石斛、落叶松、鹿茸、壁虎等。本发明的特异性PCR鉴定方法具有特异性强、操作简便、鉴定结果重现性好的特点。
3. 基于DNA序列分析的鉴定技术？它主要依靠DNA测序和生物信息分析。以DNA条形码技术为例，它是利用一个或几个短的标准DNA片段作为分子标记建立的物种鉴定。方法。物种有种内变异和种间变异。正确分类的物种的种间变异大于种内变异，因此物种之间存在遗传间隔，即。 DNA条形码技术以通用DNA片段为基础，在充分样本采样的基础上，通过种内变异和种间变异的两两比较来区分物种。近年来，中药材DNA条形码鉴定研究发展迅速。 2010年版《中国药典》增补收录了《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》。 DNA条形码技术具有方法通用性强、鉴定结果重现性好、易于数据集成和标准化等特点。
中药鉴定的两个核心任务是鉴别品种真伪和评价质量。目前开发的中药分子鉴定技术大多以真伪鉴定为目的，对质量鉴定较少。优劣评价除与遗传基因有关外，还受环境、药用部位、发育阶段、采收、加工等影响。动植物的表型特征（包括形态、性状、显微、化学等）等））与遗传信息（DNA）有机结合，从表型性状和遗传信息两个层面进行表征，选择多种方法和角度进行鉴定取证，实现中药鉴定的客观化、规范化和准确性 药物。
2. 分子鉴定的基本原理
(1)动植物物种形成
1、物种的概念？物种（）是自然界中实际存在的生物类群单位，是生物学各学科研究的基础。任何生物体在分类学上都可以分为特定的物种。中药真伪鉴别实际上就是品种鉴别。 。物种定义有20多种，包括形态物种、生物物种、生态物种、进化物种和系统发育物种。目前，生物界已基本形成共识：“物种并不是直接由个体组成，而是个体在时间和空间上有规律地形成种群，然后种群有规律地形成物种。物种是由一个或多个个体组成的”。甚至许多不连续的群体。”
物种是形态相似、能够相互交配并且需要相似环境条件的生物个体的总和。从现代遗传学的角度来看，物种是一个具有共同基因库并与其他群体生殖隔离的群体。可见，物种是一个群体，具有形态、地理分布、生理、行为、繁殖等诸多特征。区分物种最重要的依据是有无生殖隔离。
种群是同一物种的一组个体，通过个体之间的交配维持共同的基因库。每个物种都有一定的生活习性，需要一定的生存场所，但在该物种分布的整个区域中，它能生存的地方总是与它不能生存的地方隔开。因此，每个物种总是在其分散且不连续的居住地或地点形成大大小小的群体单位。每个群体单位是一个人口。
同一物种不同种群的个体，如果消除隔离，可以相互交配，即可以进行基因交换。不同物种的各个群体，即使生活在同一地区，也不能杂交，即不存在基因交换。换句话说，同一物种的种群之间存在地理隔离，不同物种的种群之间存在生殖隔离。
2. 物种的形成？物种形成()或物种起源( )是指物种的分化，是生物进化的主要标志。物种形成是一个物种内某些个体的遗传变异产生新物种的过程。对于有性繁殖的物种来说，同一物种的一群个体获得与同一物种的其他个体的生殖隔离的过程就是物种形成的过程（图3-1）。
图3-1 物种形成
（1）物种形成的步骤首先是由于地理屏障将两个种群彼此隔离，阻碍了种群之间个体的交换，从而阻碍了遗传交换，称为地理隔离（n）。与此同时，两个地理上和生殖上隔离的种群独立进化以适应各自的特殊环境。如果地理屏障消失，两个种群的个体可以再次相遇和接触，但由于生殖隔离（n）机制的建立，基因交换不再可能，于是它们成为两个物种，物种形成过程完成。
(2) 物种形成方法
①逐渐物种形成（）：分为遗传型和分化型两种。是指产生物种形成的原始物质发生突变，影响物种形成方向的选择和物种形成必要条件的隔离等进化因素。在相对较短的时间内，在长期的进化过程中，原始物种不断发生变化，原始物种形成了几个亚种；突变的进一步积累导致生殖隔离和新物种的形成。在生物世界中，许多物种都是这样形成的。
②爆炸性物种形成（爆炸性物种形成）：指一个祖先在短时间内产生两个或多个后代物种，而无需经历漫长的进化历史。一般来说，不经过亚种阶段，新物种是通过同种或异种个体之间转座子的转移、染色体加倍和调控基因突变而逐渐形成的。其中，杂交和多倍体化是爆炸性物种形成的两种主要方式。在植物界中，大部分植物的进化历史中都发生了杂交和/或多倍体化。
(3)植物和动物物种形成方式的差异
① 动物具有高度发达的行为，因此行为隔离在物种形成过程中发挥着重要作用。植物主要在陆地上无柄生活，其组成部分的数量差异很大，并且普遍进行无性繁殖，因此单性可以长期繁殖而无需交配。植物也比动物更容易产生多倍体，新物种可以通过多倍体自发产生。
多倍体有两种类型：同源多倍体（ ）和异源多倍体（ ）。例如，二倍体物种具有 AA、BB、CC 和 DD 染色体，其同源四倍体具有 AAAA、BBBB、CCCC 和 DDDD 染色体。通过减数分裂形成的配子可以将2与2、1与3、4与0分开。当二倍体配子与正常单倍体配子结合时，就会产生三倍体杂种。虽然三倍体杂种不能有性繁殖，但它们可以通过营养繁殖广泛传播。许多药用植物，例如人参和大黄，具有多倍体。
② 有时新物种无需地理隔离即可形成。自然界还有另一种物种形成方式，往往只需要几代甚至一代，而且不需要地理隔离，例如多倍体植物的形成。自然界中几乎一半的被子植物都是这样形成的。
植物物种形成的另一个重要特征是比动物更容易产生杂交后代，即杂交育性高。例如，原本因生态或地理隔离产生的两个亚种或物种，当屏障打开时，通过杂交产生杂交后代。这是经常出现大量具有各种表型的杂交个体，可称为杂交群体（ ），如柑橘属和蔷薇属的一些药用植物。
(二)中医体系鉴定
中药系统鉴定方法（SICMM）是以DNA测序技术和开放DNA数据库为基础，结合中药性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等技术手段，对未知药材进行鉴定，是一种综合性、系统性的综合鉴定方法，采用多方法、多角度验证鉴定，判定中药的原真性、真伪，实现中药鉴定的客观化、规范化、精准化。该方法的突出优点是实现了快速识别与精准识别的完美结合。它将有效利用强大的开放DNA数据库资源的优势，结合简单快速的性状与显微鉴定的特点，实现中药的准确、客观、快速鉴定。 。该方法不仅极大地弥补了单纯依赖鉴定人员经验的性状鉴定方法的缺陷，达到了中药材客观鉴定的目的，而且利用了快速发展的DNA的强大资源。开放数据库，有利于生物药材全球范围的实现。准确鉴定，特别是对于疑难药材的鉴定，具有无可比拟的优势。
中药系统鉴定方法的基本原理是充分整合动植物药材的遗传信息DNA及其动植物形态、药材性状、显微特征、组织或组织化学特征等表型信息。细胞等，然后按照一定的分析方法如动植物分类方法、性状鉴定方法、显微观察方法、理化反应、分子鉴定方法等，进行多角度、多层次的分析。未知药材鉴定（图3-2）。
图3-2 中药体系鉴别方法
中药系统鉴定方法的核心是紧紧抓住生物信息的两个核心要素，即“遗传信息”和“表型特征”，实现生物药材的客观、精准鉴定。 “遗传信息”是DNA序列信息。随着动植物DNA序列信息数据库的不断丰富，大部分生物DNA序列信息将在全球注册；因此，应充分挖掘和利用国内外开放的DNA信息资源，为中药DNA鉴定提供依据。一般方法是将未知中药材样品的DNA片段的测序结果与已知数据库的DNA序列进行比对（如BLAST分析等），初步确定中药材样品的物种起源。在此基础上，与中药材性状、显微特征等信息进行比较，相互支持，保证鉴定结果的准确性。
中药系统鉴定方法的具体实施过程主要包括：①首先对待鉴定样品进行基本鉴定（针对完整的原植物）和性状鉴定（针对药用植物的药用部位或药片）；明确样本的形态和行为特征； ②然后将鉴定样品切片、粉碎，取一部分进行显微鉴定，并按照相关显微鉴定方法进行操作，明确待鉴定样品的显微特征； ③必要时可对药粉的化学成分进行初步分析判断，如生物碱、皂苷、黄酮等的物理化学显色反应，或薄层色谱分析等； ④ 将药粉进一步研磨，提取DNA，选择合适的引物，PCR扩增相应基因的DNA序列； ⑤根据DNA序列信息，采用B LAST分析等方法与数据库中的DNA序列信息进行比对，进行聚类分析，明确对象的科属； ⑥ 整合①至⑤（②③可选）信息，系统鉴定未知药材的种类，达到准确鉴定的目的。可以预见，中药系统鉴定方法在中药新资源开发、民族药研究、名贵药材鉴定、进口药材鉴定等方面将具有广阔的应用前景。
(3)中药双分子标志物鉴定
目前，用于中药鉴定和评价的分子标记主要集中在通过单一DNA分子标记对不同品种的中药进行鉴定以及不同群体之间的遗传多样性分析，或者对同一种中药进行评价。基于单一指示剂化学成分的不同来源和来源。 ，不同发育阶段的品质差异。然而，由于中药动植物进化机制复杂，杂交、基因转移、多倍化、混种栽培种质等都会导致DNA序列信息对某些物种不具有区分能力或产生错误的鉴定结论。而且，中药是一个由多种成分组成的复杂系统。通过单一或部分指标成分来评价其质量，不能反映其整体效果，具有一定的局限性。
双分子标记法（Thods，简称BIMM）是一种将DNA分子标记和代谢标记相结合的分析方法。是在分子水平上同时研究中药产地和品质差异的分子标记方法。双分子标记方法中的DNA分子标记是指能够反映中药物种个体或群体之间基因组差异的特定DNA片段，用于中药物种遗传信息分析。可以根据不同的研究对象筛选合适的DNA分子标记，通过分析其多态性可以获得不同研究对象的特征DNA序列。中药代谢产物是治疗疾病的物质基础，代谢标志物的定性定量分析关系到用药的有效性、安全性和稳定性。中药代谢产物成分复杂。植物药中的活性成分大部分是次生代谢物，而动物药中的活性成分大部分是初级代谢物。随着代谢组学和高通量、高灵敏度、高精度光谱分析技术的发展，非选择性、近全景代谢物分析，结合主成分分析、聚类分析等统计分析方法，将有效寻找能够区分不同来源、不同产地、不同年代、不同部位的中药材代谢标志物。
DNA分子标记和代谢标记综合分析，将中药材遗传信息多态性与其性状、化学成分表型定性、定量分析相结合，建立与药材品质紧密联系的双分子标记技术平台，用于鉴定中药材的质量评价，具体工艺流程如图3-3所示。目前，双分子标记方法在中药多来源鉴定、年代鉴定、产地鉴定、优良种质分析、新药资源搜寻与开发、中药新品种保护等方面发挥着重要作用。
图3-3 双分子标记法技术流程图
三、中药分子鉴定应用范围
(一)中药分子鉴定的使用原则
随着分子生物技术的快速发展，大量药用动植物基因序列被公开。这些公共遗传资源为各科研领域的发展奠定了良好的基础，也加速了中药分子鉴定技术的发展和应用。然而，由于生物进化机制的复杂性，例如多倍体化（例如多倍体化（例如，大黄属），水平基因转移（例如，），杂交（例如，属， Genus），基因侵入和辐射（例如） 属）树突状，）和不完整的物种谱系分类通常会导致物种树木和基因树之间的不一致，导致目前报道的DNA条形码序列在某些物种之间没有歧视能力。因此，即使真实和假冒的药物源于不同物种，它们的DNA条形码序列也可能相同，这可能会导致鉴定结论中的错误。
传统中药的分子鉴定的本质是物种的定义。如何定义某种传统中药的物种边界和种内变异范围是传统中药分子鉴定的瓶颈问题。分子系统研究是解决此瓶颈问题的强大工具。没有分子系统分析的传统中药的分子鉴定就像“盲人接触大象”。它不可避免地是盲目的，并且单方面，并且得出的结论不可避免地不可靠。为此，提出了一种分子鉴定的两步方法：首先，建立已鉴定出的中国药物的属的完整物种样本（包括药物和非中性物种）的分子系统数据库（包括药物和非中等物种），然后比较数据库中确定的中国药物以确定其特性。属于。数据库的物种全面性决定了识别系统的可靠性。
另一方面，有许多类型的中国药物，具有悠久的使用历史和复杂的来源。一些药物来自野外，一些药物来自培养。他们的进化历史不同。此外，外国物种的引入以及商业贸易的发展已经人为地改变了种群和物种之间的基因流，从而引起了药物与植物之间的杂交或杂交。基因渗入程度已得到进一步增强，例如在培养的药植物中生殖的明显混合。因此，建立某种药物材料分子鉴定方法不能证明其他药物品种也具有建立分子鉴定方法的条件。有必要采用案例分析的原则，即对特定药物材料品种进行逐案评估并逐渐推进它们。在理解和掌握品种之后，在满足特定情况之前，不应就中药的分子鉴定和使用得出结论，更不用说获得完全批准或拒绝了。在确认药物物种树与基因树一致的前提下，可以选择适当的基因片段来分子鉴定中医。由于物种的生命形式（木质和草本）和形成方法（进行性分化和适应性辐射）的多样性，物种之间基因的进化速率存在很大差异，这使得分辨率中的遗传标记可能很高。在一个组中，在另一组中非常低甚至没有分辨率。到目前为止，还没有理想的遗传标记可以区分所有植物群，因此我们不能盲目寻找高分辨率的“通用标记”。一种用于选择传统中药DNA条形码的可行方法是“分层识别系统”，也就是说，首先确定整个植物王国中具有中等进化率的基因片段为核心条形码，然后寻找高进化速度在家庭或属级别。这些基因用作辅助条形码。目前，在陆地植物的核心条形码（？mat？k+？rbc？l或ITS）上达成了共识，筛选辅助条形码并建立基于特定组中药用植物基因组的标准系统可能是之一。未来的开发方向，用于分子鉴定传统中药。 。
简而传统中医分子鉴定的应用。
（2）传统中药的分子鉴定应用范围
DNA分子是高度稳定的，DNA多态性几乎覆盖了整个基因组，并且在痕量样品和发现的标本中仍然可以检测到DNA标记。 DNA分子标记技术用于鉴定传统的中药及其基本物种。它具有强大特异性，良好稳定性，微量量，便利性和准确性的特征。它特别适合密切相关的品种，易于混淆的品种，稀有品种，破碎的药物和旧药物。鉴定诸如腐烂的药物材料，植物模型标本和中药的出土标本等珍贵样品的鉴定，样品的样本量极有限。但是，识别不同药用部件存在某些局限性。
传统中药的分子鉴定将在快速，简单且高度自动化的方向发展。将来，诸如基因测序，基因芯片，免疫测定和荧光标签之类的检测方法将被广泛用于传统中药鉴定领域。
第2节在药物标准下的传统中药的分子鉴定方法
1。特定的PCR识别
（1）特定PCR识别的概念和原理
特定的PCR鉴定是基于DNA序列的特定区域，在真实和假冒药物材料之间存在差异，设计了特定的真实鉴定引物，建立了PCR反应及其产物检测方法，并根据地道和真实的产物进行区分电泳带的大小和存在。假冒产品，从而意识到了传统中药的识别。此方法只需要一种简单的“ +/-”方法来在检测过程中执行基因分型，并且检测易于自动化。特定的PCR技术可以识别具有DNA序列差异很大的真实和假冒产品，并且还可以识别与序列之间仅有基本差异的密切相关和易于混合的品种，即位点特异性PCR（ - ，AS-PCR）。
AS-PCR是一种基于PCR扩增而开发的SNP打字方法，是一种不匹配的扩增突变技术。当真实和假冒药物材料的基因序列之间存在稳定的单碱基差异时，可以在PCR引物的3'端设计差异碱基，即引物完全匹配真实产物的基因序列，虽然它匹配3'端假冒产品的基因序列。有一个基本不匹配。由于缺乏TAQ DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性，因此伪造基因序列的扩增和扩展反应受到形成磷酸键的困难。当不匹配的基础数量达到一定水平，或者在严格较高时的条件达到确定性时，放大速度将大大削弱，那么3'末端基因的磷酸二酯键将很难形成，并且不能扩展，不能扩展，无法扩展，反应将被终止，目标带无法获得；而真实的模板DNA完全匹配底漆的3'端子底座。放大不受影响。放大反应后，只有真正的基因序列有效地扩增，并且可以通过凝胶电泳模式检测到真正的和假药材料之间的基因序列差异。许多研究表明，在大多数情况下，有必要优化识别PCR反应系统和参数。通常，特定的放大可以在非常高的退火温度下完成，甚至在某些情况下，即使在非常高的退火温度下也可以完成。 ，假阳性放大也将发生。因此，为了提高识别引物的特异性，在底漆设计期间，底漆3'末端的第二或第三碱基被突变，因此底漆在该位置将模板不匹配，并且更延迟了最后的底座。在3'结尾。基于完全不匹配的模板的PCR扩增，从而增加了完全配对模板的PCR扩增的特异性。
与其他方法相比，特定的PCR技术具有简单操作，低成本和良好的可重复性的优势，这些功能反映在以下：①特定的PCR技术是一种非常可靠的基因突变检测方法，特别适合于检测基因位点突变。它的反应条件与普通PCR的反应条件基本相同。只要识别引物是正确设计的并且PCR反应条件是适当的，就可以避免假阳性放大产物的发生。 ; ②基于特定识别引物的设计的DNA序列信息不仅可以通过对相关物种的靶DNA进行测序获得，而且可以从公共DNA数据库中获得，从而大大减少工作量。 ③DNA质量要求不高。 ，所需的DNA量很小； ④PCR识别频带是单个的，确定真正的和假药物的标准是简单可靠的，而无需进行测序和软件分析。
（2）特定PCR识别的主要步骤
1。收集（收集）和样品保存？收集（收集）和样品的保存是中药分子鉴定的非常重要的联系，也是确保测试结果准确性的必要先决条件。样品的类型主要涉及基于动物和植物以及假药材料的真正药用材料。
2。通过数据库检索或测序获取真正和假冒药物的DNA序列信息？数据获取是筛选传统中药分子鉴定的DNA标记的先决条件。可以通过公共数据库获得相关的DNA序列信息，但是需要筛选这些DNA数据的准确性。对于那些不包括在数据库中的DNA序列信息的药物材料，可以通过提取样品的总DNA，扩增目标片段然后对其进行测序，从而获得药用材料及其原始动物和植物的DNA序列。
主要数据源包括Life Data （BOLD）数据库（）的条形码，该数据库是一个用于条形码编码的中央数据库，具有超过500万个条形码序列； NCBI数据库（）是美国国立卫生研究院国际核苷酸序列数据库的成员。它由三个部分组成：日本DNA数据库DDBJ和欧洲分子生物学实验室数据库EMBL；专利序列数据可以通过中华人民共和国的国家知识产权办公室，美国专利商标局和国际专利局获得。
3。屏幕上伪造药物材料之间的地点差异？识别位点是指药物材料及其原始假冒产品之间不同的核苷酸突变，包括基本插入，缺失，突变等。使用序列比较软件找到合适的识别位点，以提供进一步识别引物设计的基础。
4。根据标识地点设计特定的引物和通用引物？引物的质量与PCR特异性扩增的成功直接相关。因此，目标片段，引物长度，GC含量的最佳设置区域以及3'端密码子，碱基分布，二级结构，二聚体等因素对PCR扩增结果的影响。
（1）正宗药物材料的正向引物的3'端需要是SNP位点，这称为识别引物。识别引物的3'末端完全匹配SNP位点的真实基因型。
（2）识别引物的3'端的第二个碱基人为地引入了不匹配。不匹配应满足以下要求：如果真实识别引物的3'末端与模板（g/a，c/t，t/t）形成很强的不匹配，则引入的第二次不匹配应该是弱的不匹配（ c/a，g/t），反之亦然；如果它是中等不匹配（A/A，C/C，G/G），则需要再次引入中等的不匹配。
（3）由于人为地引入了标识底漆的3'端的不匹配，？t？m？与识别引物相对应的通用引物的值应比识别引物低2至5°C。
（4）真实和假药材料的PCR产品应在150至500 bp之间。
5。从药物材料中提取总DNA？如何从药用材料中有效提取DNA已成为传统中药分子鉴定的关键步骤。由于药物材料的复杂来源，植物细胞通常含有植物多糖，植物多酚，木糖，果胶，腐殖质，单宁，单宁，多胺和其他物质。在提取过程中，将与DNA发生复杂的化学反应，从而导致严重的后果。干扰并影响后续实验的成功。此外，大多数药物材料都经历了一些收获后的初步处理甚至处理。例如，长期暴露，高温干燥，出汗等将破坏药用材料DNA的完整性，因此与新鲜材料相比，从药用材料中提取DNA要困难得多。有关特定方法，请参阅第2章，第1节“ DNA提取和纯化”。
6。进行靶DNA片段的扩增反应？与普通的PCR相比，特定PCR的反应条件更为严格。传统中药的分子鉴定过程通常包括两个PCR反应，即用于评估DNA质量的通用引物PCR和用于识别真正和假冒产品的特异性引物PCR。
必须通过大量样品进行验证设计的识别引物，以确保所有正宗的药物材料都可以在某些条件下放大频带，而假冒产品在相同条件下不能扩增带。优化筛选识别引物的PCR条件。特定的PCR可以通过优化因素，例如退火温度，变性温度，退火时间，变性时间和影响PCR反应的周期时间，并研究PCR机器和PCR机器的不同模型，以及TAQ DNA聚合酶获得最佳的PCR反应条件。建立一种特定的PCR识别方法：①位点中PCR的引物序列的引物序列严格依赖于SNP位点的上游和下游序列。当AT含量太高时，重复的序列或严重的发夹结构出现在现场周围，这是困难的质量引物会导致遗传类型的障碍。 PCR条件需要严格的要求。例如，更换时？塔克？ DNA聚合酶或PCR仪器，需要调整退火温度。
7。PCR产品？电力技术是中医分子鉴定中常规的核酸检测方法。它可以通过观察DNA扩增片段的现有或尺寸差异来确定药用材料的正假，即，如果检测到检测片段和真正的药物材料，并且真正的药物材料DNA片段的大小相同，并且样品可以是相同的，并且可以是从生物学意义上讲是真正的产品。
（3）特定PCR在中药识别中的应用
特定的PCR评估技术主要用于鉴定中药材料，中药切片及其基本物种。一些传统的中药品种，例如濒危，假货和市场上的混乱，例如金钱和白花，金银花蛇，金银花，金银花，金银花，金银花，金银花，金银花，金银花，金色和银色花朵，金银花，金银花，金银花。人参王子，山药，人参，树突，Xi 等进行了特定PCR识别方法的研究和应用开发。
毒蛇和黑蛇片剂聚合酶链反应识别方法的“中国药典” 2015年版是一种特定的PCR方法。以下是使用毒蛇分子识别方法作为示例来说明特定的PCR方法。特定的操作过程。
1。模板DNA提取？取0.5克该产品，放入牛奶碗中，加入适当量的液氮，将其完全研磨成粉末，取0.1克，放置1.5毫升离心管，加入275μl的消化溶液，加热水浴在55°C下，在1小时内加热水浴，在1小时内加热250μl的裂纹缓冲液，混合良好，添加到DNA纯化的柱中，离心（速度为每分钟10000 rpm）持续3分钟；放弃过滤器液体，添加800μl和离心机（速度为每速速度的速度为每一速度（每个速度为每个速度）1分钟1分钟）1分钟；放弃过滤器液体，反复洗脱3次，上面有上述液体洗脱液，每个离心液（每分钟10000 rpm）放弃过滤器液体，然后离心2分钟。离心管，加入100μl无菌双蒸水，在测试管2分钟后，离心管（速度为每分钟10000 rpm）持续2分钟，将液体溶液作为测试产品溶液，设置-20°C为了保存以后的使用，用于备用解决方案。
2。PCR反应鉴定底漆？ 5'-3'和5'-。 PCR反应系统：在200μl离心管中，反应的总体积为25μl，反应系统包括10×缓冲液2.5μL，DNTP（2.5mmol/L）2.5μl，模板0.5μL，？塔克？ DNA聚合酶（5U/ 5U/μL）0.25μl，将无菌双蒸水加到25μl中。将离心管放入PCR仪表中。 PCR反应参数：95°C溢价5分钟，循环反应30次（95°C 30秒，63°C 30秒），并延伸（72°C）持续5分钟。
3。电测试？电器葡萄糖凝胶电泳方法用于特定的PCR检测。胶的浓度为1％，核酸凝胶染色体被添加到胶中。 DNA分子量样品样品量为2μL。电泳结束后，在凝胶影像制或紫外线投影仪器上检查凝胶膜。在测试产物中的凝胶测试中，在对应于对照药物凝胶电泳的相应位置，应在300至400bp下有一个DNA带。
真实毒蛇的凝胶电泳图及其20个相关假货如图3-4所示，8批毒蛇的电泳图如图3-5所示。结果，毒蛇在300至400bp的单个膨胀带中具有单个扩展带，伪产物没有放大器带，表明识别方法可以准确地将毒蛇与假货分开。鉴别。
图3-4伪蛇药物及其假货的PCR结果不同
1。积极对比； 2。毒蛇； 3.宝藏脖子蛇蛇； 4。圣苏金蛇； 5。双白戒指蛇； 6。灰色老鼠蛇； 7。8。红色点Jin Snake; 9。 Snake； 10。红链华蛇； 11。中国水蛇； 12。短吻振动蛇； 13。; 14。蛇； 15。红兰迪蛇； 16。铅色蛇； 17。金戒指蛇； 18。 Iron Head Snake； 19。黑色眉毛锦缎； 20。 21。黑蛇； 22。金钱白花蛇； 23。空白； M.DNA分子质量标准比较，从上到下，750bp，500bp，250bp，100bp
图3-58不同批次的Viper药物材料PCR识别结果
1。积极对比； 2-9。毒蛇; 10。阴性对照； 11.
M.DNA分子质量标准：从上到下到750bp，500bp，250bp，100bp，100bp
2。PCR-RFLP识别
（1）PCR-RFLP识别的概念和原理
聚合酶链反应限制的酶切割长度多态性（PCR-RFLP）是由PCR技术和核酸限制酶切割技术生产的分子鉴定技术。因为RFLP中使用的DNA必须完整，否则会影响图形的准确性和重复性。但是，在实际的识别和测试中，已经处理和处理了大多数中国药物的样本，并且DNA在不同程度上损坏，因此RFLP不广泛用于中药材料识别。 PCR-RFLP和RFLP的原理相似。区别在于，前者首先使用PCR扩展了特定DNA区域获得的靶基因序列。 。由于PCR可以获得大量的DNA片段，并且只能分析小节段中特定DNA的切割，因此不受样品DNA质量的影响。
中药材料及其假货大多接近与它们密切相关的物种。他们通常可以施加相同的底漆来扩展相同的大小，只有通过核酸电泳才能区分这些物种。虽然导管段中可能存在序列SNP识别位点序列核的分化序列。这些识别位点可以位于受限的内切酶识别序列上，因此酶切割点出现或消失。这样，将适当的受限内酶切成相同长度的酶。可以通过核酸电泳来区分它，以实现识别或识别物种的目的。
PCR-RFLP方法的建立基于已知的中药材料及其假基因序列和SNP位点，并且SNP位点必须位于受限的内部切酶识别序列上。因此，这种用于未知序列物种的方法无法获得令人满意的结果。但是，由于它不需要高质量的DNA，因此不需要使用同位素，也不需要序列序列即可获得良好的结果。它具有简单方法，更好的差异特异性和所需的DNA量的优点。目前，中药材料的鉴定与中药的识别尤其不同。它被广泛用于识别近距离物种。
（2）PCR-RFLP识别的主要步骤
1。样本收集（收集）集和保存？有关特定操作，请参见本节中特定PCR标识的主要步骤。
2。获取中药阳性假货的DNA序列信息？大多数PCR-RFLP识别标记来自核基因片段的扩大，例如其和18S，Coⅰ，COCT，CORT？ B和其他线粒体基因片段还是？ psb？一个-？ trn？ h，？ trn？ l-？ trn？ f，？垫？ K，？ rbc？ L和其他叶绿体遗传片段用于比较这些遗传碎片，以找到中药材料的阳性假DNA序列。 SNP网站。有关特定操作，请参见本节中特定PCR标识的主要步骤。
3。过滤中草药物的阳性和假货之间的DNA序列的位点？在真正的中国药用材料上获得鉴定位点以及伪产物DNA序列的DNA序列相对较小，并且受限的内酶内酶识别序列主要是严格的返回序列。在基因组组中出现的可能性不高。有一个酶切割点。尽管某些端识识别序列具有简化，但内部酶的数量相对较小，并且可以购买的商品类型的类型的酶类型。该站点被分析为PCR-RFLP识别方法开发的重要组成部分。通过限制匿名酶位点的分析软件，将检测到的SNP分析为检测到的SNP，以及导致酶切割点变化的SNP。
4。根据标识地点设计通用底漆？除了一般底漆设计的设计原理外，通用引物膨胀的目的还应包括在DNA之后筛选SNP识别位点。切割受限的内同变酶后获得的大小，可以区分琼脂糖凝胶的尺寸。每种酶 - 切开DNA片段的分子量应大于100bp，以促进随后的葡萄糖细胞电泳检测。
5。提取药物材料的总DNA？有关特定操作，请参见本节中特定PCR标识的主要步骤。
6。建立PCR扩增目的DNA反应系统？内酶切割过程的限制对DNA底物的数量和定性具有严格的要求。优化周期数，建立合适的PCR响应程序和系统，并获得高质量的目的地DNA。
7。建立限制性端酶切割反应系统？通过PCR获得的DNA通过底物浓度的浓度，限制性末端酶浓度，酶切割时间，时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间，酶切割时间为了优化诸如酶切割温度之类的因素，建立一个合适的限制端酶切割反应系统，并获得酶 - 切割DNA片段。
建立PCR-RFLP识别方法：①当PCR扩增时，严格控制模板浓度和纯度。如果DNA模板浓度太高，则将出现非特异性扩增条。 。 ②以适当的量增加扩增产品的量。 DNA聚合酶浓度太低，这将导致较少的产物甚至没有频带，并且高浓度会产生非特异性带。 ③内部酶的量太小，无法达到切割酶的作用。太多会导致浪费或主演（也称为恒星活动，指的是内部酶识别位点的变化，有时是识别特异性的丧失），酶切割时间太短。 ④与仅使用PCR相比，当添加受限的内部酶时，PCR-RFLP需要打开离心管盖，这也增加了DNA污染或降解的风险。由于PCR-RFLP检测过程中的酶切割时间很长，因此该方法的整个实验时间超过5小时，这不利于快速识别。前景。
8。琼脂凝胶的电能？根据酶后DNA片段的分子量，选择适当的琼脂糖凝胶进行电分离以获得理想的酶切割谱。如果样品酶切割与控制药物酶的控制一致，则可以将其判断为生物学意义上的真实性。
（3）PCR-RFLP评估在中药识别中的应用
PCR-RFLP评估方法适用于具有基因序列信息的更完整的中药品种。目前，该技术用于识别中国传统药物，例如大黄，，Zexie，和Human 。以下基于聚合酶链反应限制的内部切酶长度多态性鉴定的“中国药典” 2015年版本，以说明PCR-RFLP在传统中药识别中的应用和特定操作过程。
基因组rDNA的ITS1部分的第75个基础是“ C”，而是“ T”的其他品种。鉴定序列的酶切割位点），而不是在该位点作为该位点的序列的该位点位置的DNA序列，没有切口点（图3-6）。因此其他。
图3-6 NRDNA-ITS1的母亲的九种核苷酸序列差异的区域部分
该点与母亲的母亲相同？ F？ ???深色盒显示了4种四川北京物种的序列有限的内切酶？ SMA？ ⅰ酶切点（），在浅色框中显示的其他物种的顺序显示
通过设计 的通用底漆，可以扩展308bp的PCR产品。 的PCR产品序列中只有一个。消化和切成长度的两个片段为118bp和190bp，即两个酶 - 切割带出现在100至250bp之间，而不是没有这种酶的酶切割位点的四川壳。乐队（图3-7）。
图3-7的10种植物（ITS1）的PCR产物（IS1片段）。
F1。叶子的？ f？ ??; f2。 ？ f？ ??）; F3。 ？； F5。 ？ f？ ??; 7. ？ F？ ??; f8。 Hubei ？ F？ ???; ？； F11。 of ? F?. ??; MK was a of DNA
3. DNA
(1) The and of DNA
was used in the , which the rapid and of goods. This is an that and in , and is an means to fast, and of data. The of DNA is to the of .
The DNA is a of rapid and of using a or short DNA . Paul () first to use a small gene as the of the in 2003. Put the idea of . The DNA can by a DNA with in the . this DNA is to each . Each site has four genes: A, T, G, and C, which can be all on the earth. The of this the from . In 2004, the Life Bar Code (, CBOL) was in the , which is to the and unity of for .
The core of the DNA is to a gene -based . , the that have lost form or at of life can be . . The DNA is more and , easy to and . To a , it on and , and can an easy -to -use in a short of time. DNA has broad in the of and , , food , , and , , and .
(2) The main steps of DNA
1. The and of and plant ? and wide is one of the that the of the . The of be all by the drug . The of is to a DNA of the basis and core of the . , a and is for a . It is the and of of . The of plant in the wild the of the , the plant and the of the plant and the image or of the plant's own plant and the of the plant . The must be a with of , which roots, stems, , , , and other (such as buds, bulbs, ball roots, etc.). Due to the of and , many will be lost after the is , such as color and . , it is to and take of the of in the wild, and . In the end, the of the are to the . For (such as trees and , etc.) with body shape, it is to that from the same plant come from the same plant. (such as the color, odor, etc. of ) and .
The of the : ① (): The to the given by the to each the of the in the wild. Each has the . ② (): The the , the , and the genus, and the . ③ (): The is the used in the the DNA . It can be of and . For , it is to use with the same as the .
Put the newly and plant in a paper bag and seal it, then place it in a dry box (box) with good , and put to cover all the for fast ; a dry box (box) , put the plant in a paper bag and it, and then put it in a self -seal bag and add of for fast . If the pink or red, it be in time until the color - is kept as blue, that the is dry.
2. of DNA? For , see the main steps of PCR in this .
3. of DNA ? As a DNA for , it that have a -based to form . The DNA has the : ① There must be of to . At the same time, the DNA is as as , and the in the is than the . In ; ③ The DNA area to the of the in the ; ④ have a area to the of , DNA and ; ④ DNA be short to DNA Can .
In , is at least 5 times than a DNA. , it is to use DNA for of . The of in the quilt plant is more than 5 times than the . The rate of the is only half of the group of the plant. It is far less than the . You a and gene for and .
The four plant DNA by the Life Bar Code and their , , , and are . See Table 3-1. The 2 pairs of by RBC? L have high . You can any of the pairs of for the and of . and can refer to files (http: /// group/). ITS is low in seed . The ITS in Table 3-1 is a with high in seed . For some , ITS can be . There may be in the level of in types of . For with low , the can be to the .
Table 3-1 (plant) and of four DNA
Note: F is ; R is .
4.PCR ? For , see the main steps of PCR in this .
5. DNA ? a DNA is an for . The main is for the two -off - chain and its . makes it to high - and macro bars ().
6. Data of DNA ? In order to the of the DNA , it is to and or and . , not only data and , but also , which is to large -scale data . When , the needs to be to the low - parts at both ends of the . The of the be with the of the PCR . and such as PHRAP, CAP3 on the UNIX , Codon-,,,, etc.
The most used of DNA data is the BLAST , (), and the (). On the basis of fully the the of the fake , using one alone the , and need to be used at the same time to each other.
(1) BLAST BLAST () is an and based on the BLAST . First, a and a (that is, the of inter - ). for the DNA of the as the "Query " in the . to the set , if the BLAST can be in the , the that has the with the "Query " is the of the most ; The query "" be , that the bar code of the may not have the of the .
(2) of is by-2- (K2P) . The K2P is the model by the Bar Code (CBOL). The is in three : K2P , ? Θ? Value trace the (TH). The ? Θ? Value to the K2P in each . The is to the by the of due to the . The to the K2P all in the to the range in the . The K2P can be MEGA or Paup, and the two are on this basis.
(3) The tree DNA tree , such as (, NJ), UPGMA , (, ME) (, Mp), Bayes (Bayes) and so on 。 The of a is not to use the DNA to the tree, but to test the of each , that is, of the same can be . of can get , but the by are not much . In , the time of is very , and the are , and the be made as use. The most tree is the NJ .
7. DNA ? There are many that the of DNA , such as DNA, of of , and of DNA , and data . , it is to the and of the . The PCR of DNA [? RBC? L,? trn？ H-? PSB? A and ITS (ITS2)] See Table 3-2, see Table 3-3 in PCR .
Table 3-2 PCR for DNA
Table 3-3 PCR for DNA
(3) of DNA in
DNA has in the of base and above. The is based on the " DNA " in the 2015 of " ". and .
1. for ? , , chain (ION, PCR) , meter, and DNA . The DNA is a fully - meter - or size by with and data and , as well as . The is the of the dual chain, also known as the . The base of the four (DDNTP) is with . the tube, the 4 on DNA are by laser. The image (-, CCD) the , and is into a DNA to the peak map file and file of the test .
2. steps? It test , DNA , DNA PCR , and , and .
(1) Test -of -test is to and ( 0211). In order to , and use 75% to wipe the and dry it, or take other to . 10 to 100 mg for later use. The parts of the test are made to the of .
(2) DNA of DNA the use of or meter cells, into fine , and use the kit to and the DNA. At /Cell DNA kit, the test box by the must be able to the DNA that meets the .
(3) PCR plant and its base ITS2 or? PSB?一个-？ trn？ H , and its base CO Ⅰ , and As , are shown in each item. ITS2 ITS2F: 5 ′-3 ′; ITS3R: 5′-T-3 ′. ？ PSB?一个-？ trn？ H PSBAF: 5′-TC-3 ′; TRNHR: 5′-TC-3 ′. CO Ⅰ : 5 ′-3 ′; : 5'-attgg-3 ′.
The PCR is by 25 μL, : 1 × PCR ( MGCL? 2?), 2.0mmol/LMGCl? 2?, 0.2mmol/, 0.1 μmol/L pair, DNA, 1.0U? TAQ ? DNA , add water to 25 μl. Set the PCR of an DNA to a .
ITS2 : 94 ℃ 5 ; 94 ℃ 30 , 56 ℃ 30 , 72 ℃ 45 , 35-40 ; 72 ℃ 10 . ？ PSB?一个-？ trn？ H : 94 ° C 5 ; 94 ° C for 1 , 55 ° C for 1 , 72 ° C 1.5 , 30 ; 72 ° C 7 . COⅠ序列扩增程序：94℃1分钟；94℃1分钟，45℃1.5分钟，72℃1.5分钟，5个循环；94℃1分钟，50℃1.5分钟，72℃1分钟，35个循环；72 ℃ 5 .
(4) PCR gel to PCR . After the , the PCR in the DNA ( under the items).
(5) the gel where the strip is under the light, and the gel DNA kit is . Use the DNA to two -way on the strip. The PCR are used as .
(6) DNA
① : for for the two -way peak to apply the to the area.
② : In order to the of the DNA , the of the is weak or peak areas. The be with the of the PCR to the DNA .
(7) As a , the that will be will be with the of DNA by the State Drug .
3、注意事项
(1) The basic of the be in the venue.
(2) This is no