摘要：为了建立检测非洲猪瘟病毒（ASFV）抗体的间接ELISA（）方法，将构建的ASFV P30基因表达工程株诱导表达后，对获得的重组ASFV P30蛋白进行纯化和blot检测，然后以纯化的重组蛋白为抗原，建立ASFV抗体检测方法，并进行特异性、敏感性和重复性测试。同时与基于ASFV P30-2 His6蛋白（N端和C端各融合一个His6标签）的方法进行了比较。对兽医临床样品进行了比较测试。结果表明，重组ASFV P30蛋白和重组ASFV P30-2His6蛋白在-blot检测中能与猪ASFV阳性血清产生特异性杂交条带；基于重组ASFV P30蛋白的最佳反应条件为，抗原蛋白包被质量浓度为20 μg/mL，血清样品稀释度为1:1 000，酶标二抗稀释度为1:40 000，血清样本检测OD450阳性结果的临界值为0.22。该方法仅对 ASFV 阳性血清产生特异性反应。阳性血清稀释1:3 200仍可检出。批次内和批次间检测变异系数均小于10%，可消除His标签引起的假阳性反应。本研究建立的ASFV P30检测方法为ASFV抗体检测提供了有效手段。
非洲猪瘟（ASF）是一种病毒性疾病，对家猪和欧亚野猪具有极高的致命性和传染性。它给世界生猪养殖业造成了巨大的经济损失，已得到世界动物卫生组织（OIE）的认可。 ）被列入法定动物疫病名录。非洲猪瘟于 1909 年首次在肯尼亚定居者饲养的猪中发现，并于 1921 年作为一种不同于传统猪瘟的疾病被报道； 1957年至1960年，非洲猪瘟两次从西非传播到葡萄牙。然后它传播到加勒比海地区以及巴西和欧洲的其他国家。 2018年8月，我国报告首例非洲猪瘟疫情。随后，疫情在全国迅速蔓延，给我国生猪养殖业造成巨大经济损失。
非洲猪瘟病毒（ASFV）是引起非洲猪瘟的病原体。 ASFV 是一种大型二十面体包膜病毒，双链 DNA 基因组长度为 170 至 190 kb。基因组包含 160 至 175 个开放阅读框 (ORF)，编码 150 至 200 种蛋白质。这些编码蛋白中的主要结构蛋白包括：A238L蛋白、CD2v蛋白、多基因家族蛋白、P54蛋白、P72蛋白和P32蛋白。其中，P32蛋白由基因编码，相对分子质量约为30 ku。它也被称为P30蛋白。这种蛋白质在病毒进入宿主细胞的过程中发挥着重要作用。具有良好的抗原性，在感染早期即可表达和分泌。常用于感染后早期检测免疫反应，是理想的血清学诊断和免疫学方法。检测抗原。
近年来，我国动物疫苗生产企业广泛研发各种基因工程亚单位疫苗。许多这些疫苗蛋白含有多组氨酸标签。猪使用带有组氨酸标签的疫苗后，会产生相应的抗多组氨酸抗体。在兽医临床检测过程中，如果包被的抗原还含有多组氨酸标签，就会出现抗体检测结果假阳性的情况。为了消除抗多组氨酸抗体的影响，本研究采用大肠杆菌表达并纯化无多组氨酸标签的重组ASFV P30蛋白，并以其作为包被抗原进行间接ELISA()，建立了ASFV抗体检测试剂盒。并与带有组氨酸标签的ASFV P30-2His6蛋白的检测方法进行了比较。结果发现，使用不含多组氨酸标签的重组ASFV P30抗原作为包被抗原可以消除多聚体。氨基酸抗体引起的假阳性反应。该方法的建立为非洲猪瘟病毒感染的早期检测和疫苗免疫效果评价提供了可靠的方法。
材料和方法
血清样本
猪圆环病毒2型（PCV2）阳性血清由长江大学生物医学研究所保存提供；猪塞内卡病毒（A、SVA）阳性血清由哈尔滨兽医研究所翁长江研究员捐赠；猪细小病毒（PPV）阳性血清、猪口蹄疫病毒（口蹄疫病毒，FMDV）阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清、猪圆环病毒3型（3、PCV3）阳性血清，青岛亿邦生物工程有限公司提供； ASFV阳性血清（15份，中国动物卫生流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室提供），ASFV临床阴性血清（40份，青岛亿邦生物工程有限公司提供），均为经法国 ASFV抗体检测试剂盒（ID.vet kit）和印迹法证实。
重组蛋白构建及诱导表达
根据Miao等人发表的ASFV全基因序列。 2018年10月(:)设计了ASFV P30蛋白全基因编码序列，在序列5'端添加了BamHI限制性内切核酸位点序列，同时去除。原始序列 3' 端的终止密码子添加了 Xho I 限制性位点。将设计好的序列送北京明治桑格生物医学技术有限公司进行完整的基因合成，并插入表达质粒载体相应的酶切位点。将含有ASFV P30蛋白编码序列的pET-28a质粒（pET-28a-ASFV P30-2His6）转化E.coli.BL21感受态细胞，获得E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30-2His6 。该工程菌株诱导表达的ASFV P30蛋白上下游各有一组His6标签。该菌株由我们实验室构建并保存。
根据ASFV P30蛋白编码序列合成一对PCR引物。上游引物起始密码子前添加Nco I限制性位点，下游引物添加终止密码子，3'端添加Xho I限制性位点。 pET-28a-ASFV P30-2His6用作PCR扩增的模板。扩增产物用Nco I/Xho I双酶切，与同酶酶切的线性化质粒连接，得到表达工程菌株E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30。
诱导表达重组E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30-2His6和E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30。诱导剂为α-乳糖，工作浓度为0.03 mol/L。通过离心收集表达细菌。
重组蛋白纯化
将诱导后收集的E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30-2His6湿菌细胞按照质量体积比1:10与PBS(0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4)充分混合。 。重悬、超声破碎并离心以收集上清液。用0.45μm过滤器过滤上清液，得到预处理的蛋白溶液。采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化ASFV P30-2His6重组蛋白。
将收集的E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30湿菌体按照质量体积比1:10充分重悬于pH 10.53的0.1mol/L碳酸盐缓冲液中，超声破碎。离心收集上清液，用0.45μm滤膜过滤上清液，得到预处理后的蛋白溶液。采用300凝胶过滤层析柱和DEAE Fast Flow阴离子交换柱进行分离纯化。
重组蛋白检测
将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳并测定蛋白浓度。使用 -blot 分析两种纯化的重组蛋白。使用12%分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转至NC膜上；以ASFV阳性猪血清为一抗（稀释倍数：1:5 000），37℃孵育1 h，用1×PBST（含0.05% Tween-20的PBS缓冲液）洗涤3次，10 min /时间;添加HRP标记的羊抗猪IgG抗体（1:20 000稀释）作为二抗，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，10 min/次；使用ECL化学发光试剂盒，按照操作说明进行曝光、显色，拍照分析结果。
检测方法建立
采用棋盘滴定法，将纯化的重组ASFV P30蛋白用包被液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.5）按照标准稀释法稀释至质量浓度为2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ mL，包被 ELISA 板，每孔加入 100 μL，25℃孵育 4 小时，然后倒空包被蛋白溶液；每孔用 200 μL 包被液（0.01 mol/L 磷酸钾缓冲液，pH7.2）清洗。 3次后，风干；加入200 μL封闭液（5%脱脂奶粉溶液），25℃封闭2小时，封闭完毕倒出封闭液，风干备用。用封闭液稀释ASFV阳性和阴性血清（稀释比例分别为1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000），同时加入HRP标记的羊抗猪酶-标记抗体用1×PBST缓冲液稀释，稀释比例分别为1:10 000、1:20 000、1:40 000；按常规方法操作，确保洗涤完全，用终止液（2mol/L硫酸溶液）终止反应。读取 OD450。选择标准：OD450≈1.0，阴性血清OD450≤0.1，阳性血清与阴性血清的OD450比值（P/N）最高。
分别选择1%明胶溶液、2%牛血清白蛋白溶液、5%脱脂奶粉溶液、10%胎牛血清作为封闭液。封锁2小时。分别用ASFV阴性和阳性血清进行ELISA检测，选择最佳封闭液。 。
确定 ASFV 抗体阳性的临界值
采集70份ASFV临床阴性猪血清样本，采用优化的ELISA方法进行检测。计算OD450平均值和标准差，根据阳性临界值=平均值+5×标准差确定ELISA方法的OD450临界值；假设临床样本OD值/阴性样本OD值（S/N）大于2.5，则阳性临界值为，大于此值则判定为ASFV抗体阳性，大于则判定为ASFV抗体阳性。该值判断为抗体阴性。
特异性测试
采用上述建立的检测方法，对PPV、PRRSV、FMDV、SVA、PCV2、PCV3阳性血清以及ASFV阳性、阴性血清进行检测。 ELISA检测方法的特异性是根据多次血清检测的OD450值来确定的。
敏感性测试
ASFV阳性猪血清分别按1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400稀释。采用优化的方法检测不同稀释倍数的阳性血清。根据检测结果确定阳性血清的最大稀释度。倍数来评估该方法的灵敏度。
重复性测试
将同批次纯化的重组ASFV P30蛋白包被ELISA板，对4份猪血清样品进行ELISA检测。每个样品在 4 个孔中重复，以检查该方法的批内重复性；另外 5 批纯化的 ASFV P30 蛋白用于包被平板。将重组ASFV P30蛋白包被于ELISA平板上，对ASFV强阳性、阳性、阴性血清进行ELISA，考察方法的批次间重复性。
已知样品检测对比
采用重组ASFV P30蛋白和重组ASFV P30-2His6蛋白两种检测方法对确诊的阳性和阴性血清进行检测，并评价两种方法与临床样本的一致性。使用Excel的内置程序收集实验数据。
结果
ASFV P30蛋白编码基因扩增
以pET-28a-ASFV P30-2His6为模板，使用上述引物进行PCR扩增。结果如图1所示，两个平行阳性扩增产物（a、b）大小为500~750 bp，与设计扩增基因大小一致。
重组 ASFV P30 蛋白表达
诱导表达后的重组ASFV P30蛋白通过SDS-PAGE检测。从电泳结果（图2）可以看出，去除组氨酸标签的重组ASFV P30蛋白的相对分子质量略小于35 ku，表达该蛋白的全菌液及上清液的蛋白量离心后全菌液的结果相似，表明该蛋白的原核表达是可溶性表达。
重组蛋白纯化
将纯化的重组ASFV P30蛋白和重组ASFV P30-2His6蛋白进行SDS-PAGE电泳。 Bio-Rad凝胶成像仪的灰度扫描结果（图3）显示，纯化的重组ASFV P30蛋白的纯度约为95%，纯化的重组ASFV P30-2His6蛋白的纯度约为98%。可以看出，经过300凝胶过滤层析和DEAE Fast Flow阴离子交换层析后的重组ASFV P30蛋白的纯度仍略低于Ni-NTA亲和层析纯化的重组ASFV P30-2His6蛋白。蛋白质的相对分子质量略大于35 ku。
重组蛋白印迹分析
-blot分析结果（图4）显示，重组ASFV P30蛋白的杂交条带小于35 ku，而重组ASFV P30-2His6蛋白的杂交条带大于35 ku，与预期一致，并且杂交条带均清晰，表明两种重组蛋白均具有良好的免疫反应性。
最佳反应条件设置
根据1.6棋盘滴定法的检测结果（表1），结合设定的优化原则，即阳性血清OD450≈1.0，阴性血清OD450≤0.1，OD450比值（P/N） ELISA检测阳性血清和阴性血清的比例最高；所选抗原包被浓度为20 μg/mL，血清稀释比为1:1 000，酶标二抗工作浓度为1:40 000，此时临床阳性的P/N值血清最大(19.58)，阳性血清OD450值在1.0左右。
封闭液优化结果（图5）显示，选择5%脱脂奶粉作为封闭液时，P/N值（13.06）最大，阳性血清OD450在1.0左右。
确定正临界值
阳性临界值判定结果（图6）显示，70份ASFV临床阴性样本的平均OD450值为0.104，标准差为0.024。正临界值 = 平均值 + 5 × 标准差，即 0.22。因此，当待测血清样本的OD450>0.22时，判断为ASFV抗体阳性，当OD450≤0.22时，判断为抗体阴性。
特异性测试
检测结果（图7）显示，只有ASFV阳性血清的OD450值高于0.22，即为阳性，而PPV、PRRSV、FMDV、SVA、PCV2和PCV3阳性血清的OD450值均低于0.22，即阴性，表明检测方法具有良好的特异性。
敏感性测试
检测结果（图8）显示，ASFV临床阳性血清按1:800、1:1600、1:3200、1:6400稀释。当稀释至1:3200时，OD450=0.352(>0.22)，表明该方法将ASFV阳性血清稀释1:3 200仍能检测出阳性结果。
重复性测试
检测结果（表2）显示，批次内4个猪血清样品4次重复检测和批次间3个血清样品5次重复检测OD450值变异系数均低于10%，表明ELISA方法具有良好的重复性。
临床样品检测比较
分别采用ASFV P30和ASFV P30-2His6作为抗原构建的检测方法，检测出15份确诊的ASFV临床阳性血清（表3）和40份ASFV阴性血清（表4）。结果表明，两种检测方法对阳性血清的判断结果相同。对于阴性血清，使用ASFV P30-2His6作为包被抗原，27例检测结果呈弱阳性或可疑，只有13例呈阴性，符合率为32.5%（13/40）； ASFV P30包被抗原检测，结果均为阴性，符合率为100%（40/40）。
讨论
与从受感染细胞提取物中提取抗原相比，在 ELISA 测定中使用重组蛋白作为抗原具有许多优点。这些重组抗原来源的简单性消除了因细胞化合物污染抗原而导致的假阳性反应，避免在抗原生产中使用活病毒，并允许抗原生产更好地标准化。通过基因工程生产重组蛋白，根据表达载体的不同，主要分为原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统以其背景清晰、操作简单、成本低廉等优点在实际生产中得到广泛应用。
ASFV可以在自然宿主和感染后恢复的家猪中持续存在，并且毒力较低，表明该病毒具有逃避宿主防御系统的有效机制。因此，在没有有效疫苗的情况下，只能通过扑杀来控制非洲猪瘟的传播，因此早发现、早治疗就显得尤为重要。可用于ASFV抗体检测的抗原蛋白有很多，其中P30、P72和P54结构蛋白具有良好的诊断意义。 ASFV P72结构蛋白是病毒衣壳的主要成分，也是目前研究最多的诊断靶点。以P72蛋白为包被抗原成功建立了抗体检测试剂盒。该蛋白在病毒感染后期表达，具有良好的免疫原性和较强的保守性。 ASFV P54蛋白具有很强的免疫原性，是使用印迹诊断流行病时最受关注的病毒蛋白之一。 ASFV P54主要含有线性表位，而P30主要含有构象表位。因此，这些蛋白质表位结构的差异可以解释 ELISA 和印迹中发现的 P30 和 P54 反应性的差异。与P72和P54蛋白相比，建立ASFV P30检测方法可以早期发现和治疗感染。
本研究以ASFV P30-2His6为基础，利用基因工程原理设计引物去除His标签，并以pET-28a(+)为表达载体构建ASFV P30蛋白表达工程菌株。与利用酶消化去除蛋白质中的His标签相比，本研究建立的方法在去除His标签的同时不影响蛋白质的其他性质，使得ASFV P30蛋白高表达且水溶性良好，有利于规模化生产。与吴静等建立的检测方法进行比较。等人利用pET-32a(+)载体成功表达了His标签包涵体ASFV P30蛋白，本研究表达的P30蛋白是一种水溶性无标签蛋白，更适合临床应用。它的优点是可以消除用带有组氨酸标签的基因工程疫苗对猪进行免疫所引起的假阳性。去除His标签后，不能使用亲和层析进行纯化。只能采用凝胶过滤层析和阴离子交换柱进行纯化，因此纯化相对困难。在本研究中，纯化的蛋白质进行了 SDS-PAGE 分析和灰度扫描。结果发现，纯化的重组ASFV P30蛋白的纯度为95%，而镍柱纯化的重组ASFV P30-2His6的纯度为98%。可以看出，镍柱的纯度提纯效率较高。但检测结果清楚地表明，虽然ASFV P30的纯度稍低，但不仅不影响检测的准确性，而且消除了因去除His标签而导致的假阳性检测结果，大大提高了准确性和测试的可靠性。在检测背景清晰的40份阴性血清过程中，当使用ASFV P30-2His6作为包被抗原时，有27份血清检测结果呈弱阳性或可疑，只有13份呈阴性，而使用ASFV P30-2His6作为包被抗原时，有27份血清检测结果呈弱阳性或可疑，只有13份呈阴性。抗原。当检测抗原时，40份血清呈阴性。进一步对这40份阴性血清的来源进行比对分析发现，检测结果弱阳性或可疑的血清有27份来自至少免疫过两次His标签亚单位疫苗的猪场，检测结果呈阴性的血清有13份。 ，全部来自未接种His标签亚单位疫苗的养猪场。
对于该检测方法阳性临界值的确定，单纯以OD450值作为判断依据并不能完全避免批次间或批次内不同时间段检测对检测结果的影响。不同批次试剂盒或同批次试剂盒不同时间段检测的阴性血清数据略有波动，变异系数（CV）为5%~10%。引入标准阳性（S/P，样品OD450/标准阳性OD450）或标准阴性（S/N，样品OD450/阴性OD450）可以最大限度地减少这种差异对结果判断的影响。 S/N值具有更好的可靠性和稳定性。
ELISA S/N≥2.1是国际公认的判断抗体阳性的标准。 P30蛋白检测ASFV抗体的敏感性非常高。为了减少误报的概率，S/N阈值设置为2.5。当待测血清样本的S/N≥2.5时，判定为ASFV抗体阳性（+）。 ，2.5>S/N≥2.0判定为可疑（±），S/N<2.0判定为阴性（-）。因此，本研究在特异性、敏感性和重复性试验中仅单独使用OD450值作为判断标准，而临床样本检测则同时列出了OD450值和S/N值。
综上所述，本研究建立了ASFV P30蛋白的检测方法。该方法可用于检测ASFV的早期感染，具有良好的特异性、敏感性和重复性。它还可以消除因接种带有His标签的基因工程疫苗而引起的假阳性反应。这是一个有效的方法。 ASFV 检测方法。
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