2020年
本文摘要
生物过程分析技术的核心目标是降低过程风险、稳步提高控制水平。关键途径是通过参数相关性分析来实现对细胞内代谢的解释，只有达到代谢流分析的深度才能为流程执行提供稳定、正确的信息。依据。
无论是初级代谢物、次级代谢物，还是以细菌为产品的生物过程，细菌浓度都是一个关键指标，尤其是活菌浓度。
本文一方面简单介绍了细菌浓度的离线和在线检测方法。另一方面，将重点介绍活菌的电容检测原理及其在大肠杆菌、酵母、丝状细菌和动物细胞中的典型应用。希望对您使用电容测试仪打下基础。
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01
细菌浓度测试的重要性
什么是PAT
PAT的全称是（过程分析技术），旨在通过对原材料、中间体和过程的关键质量和性能特征的实时监控，建立设计、分析和控制生产的系统化流程。
细菌浓度参数在发酵过程分析技术中至关重要
Bio-PAT的核心目标是降低过程风险，稳步提高控制水平。关键方法是通过参数相关性分析来实现对细胞内代谢的解释。而只有达到代谢流分析的深度，才能为流程执行提供稳定、正确的信息。依据。
*上图引自多尺度微生物过程优化
要实现发酵过程的跨尺度分析，可以应用很多参数，如pH、DO、OUR、CER、还原糖、氨基氮、细菌浓度等。在这些参数中，细菌浓度一直是最关键的参数：对于二级代谢物，如抗生素的发酵过程中，通过补料控制细菌的生长，使其保持一定的生长速度。如果生长速度太快，可能会引起代谢流迁移。对于以初级代谢物和细菌细胞为产物的发酵过程来说，保持细菌细胞的高密度至关重要。因此，细菌浓度与其他参数相比可以直接反映控制对象的特性。
活菌检测更重要
生物过程的产量是通过活菌来实现的，因此活菌数量对于过程分析非常重要，特别是对于基于细菌密度的生产过程。例如，在益生菌生产的每个步骤中，目标都是最大限度地增加活细菌的数量。因此，在益生菌的发酵生产中，主要目的是在单位体积的培养基中获得尽可能多的活细胞。
02
细菌检测方法综述
离线检测方式
1.平板计数法：将待测样品适当稀释后，平铺于平板上，计数菌落。缺点是操作复杂、受人为影响、检测周期长。
2、干燥称重法：湿菌体用蒸馏水洗涤后，105℃干燥（或采用红外照射）至恒重。缺点是：需要离线采样；它受人为因素和培养基的干扰。
3、离心定容法：取发酵液10ml，离心10分钟。细菌浓度为：总体积减去上清液体积。缺点是：需要离线采样，受操作影响较大，如上清液是否去除干净。
4、光密度：用水作为空白对照，稀释菌液，然后在600 nm波长处测定吸光度值，然后换算成菌浓度。该方法简单、快速、结果可靠；缺点是无法区分死菌和死菌。细胞和活细胞，不适用于丝状细菌。
5.其他方法：如显微镜检查；间接估计流动时间；核酸检测等方法。
在线细菌浓度检测
目前报道的在线测量方法有：原位显微镜法、近红外光谱法、荧光法、激光散射分析法、电容电阻法等。其中，电容法检测快速，适用范围广，是一种正在逐渐被广泛应用。
03
电容式活菌检测原理
活细胞中的极化现象
细胞膜两面都含有许多离子，细胞膜具有很强的绝缘能力，因此一个完整的细胞才能表现出电容特性。在交变电场的作用下，膜内外的正离子和负离子相互运动并稳定地分布在细胞膜周围（下图），从而建立了相对稳定的电容环境。此时细胞处于稳定的极化状态，可以传导电信号。
电容定量检测细胞浓度的基础
在不同频率的交变电场作用下，细胞液的检测电容值会随着电场频率的变化而变化。当电场变化频率较低时，电场方向变化缓慢，大多数离子在电场方向变化使细胞极化之前有足够的时间到达细胞膜边缘；当电场方向变化的频率持续变高时，某些位置的离子的迁移时间大于如果电场方向长时间停留，这些离子将没有足够的时间到达边缘细胞膜的破坏，细胞极化将不完全。此时检测到的电容值会变低；当电场方向变化的频率很高时，几乎所有正离子和负离子的流动过程都会被阻挡。此时测得的残余电容值接近于未添加细胞的培养基的电容值。这种频率增加而极化率降低的现象称为β色散现象，我们将细胞极化到特征频率一半的频率称为β色散现象。选择一定的频率进行测量，得到的电容值与活细胞的浓度成正比。该频率下的细胞浓度越高，测得的电容值就越大。不同频率下不同浓度细胞检测到的细胞电容值如下图所示：
对于同一类型的细胞，细胞直径越小，特征频率越高，因为细胞越小，极化越快；反之，细胞直径越大，所需极化时间越长，特征频率越低。因此，可以根据特征频率fc来确定平均泡孔直径。
04
什么是ABER系统？
电容法的发展历史
1957年，总结了理想球形电池的电容与单位体积膜密度、单位膜电容和测量电极等参数的关系。
1987年，Kell使用两电极法测量细胞质量。该方法使用四个铂电极，向两个电极施加特定频率的交变电场，另外两个电极作为检测电极。该方法减少了电极极化效应对测量结果的影响。
1998年，他和Noll将活细胞检测器应用于杂交瘤细胞实验。他们将电容值和施万方程结合起来，建立了电容与细胞体积、细胞蛋白质含量和谷氨酸消耗率之间的关系。进一步研究发现，分批培养过程中细胞电容与活细胞浓度之间存在良好的线性关系。
2005年，在研究活细胞探测器电极材料的腐蚀过程时，使用了陶瓷材料。陶瓷电极作为电极材料可以进一步减少电极的影响，提高测量精度。
2005年，Ana P.对比了四针和四环检测探头，发现四环电极的平均信噪比比四针电极提高了17%，证明了电极的形状对测量有很大的影响。结果将会产生一定的影响。
2010年，和SUN探索了一种测量单细胞介电参数的方法，提高了测量单细胞浓度的准确性。
商业活细胞浓度检测仪
目前，在测量系统的发展方面，国外已生产的主要商业产品包括英国ABER仪器公司。该公司开发了一种基于电容法的活细胞在线分析仪，可在线测量活细胞的浓度和培养基的电导率。
阿贝尔系统
ABER的系统因其体积小、重量轻、功能强大、应用灵活而被全球领先的生物科技公司广泛采用。系统的三个主要硬件组件是：探头（12mm或25mm或7.5mm）、主机（一体式或分体式或pico型）和信号传输发射器（单通道/四通道/八通道集线器或V350发射器设备）。
不同类型细胞的检测下限如下：
在一定的激发电场环境下，具有完整包膜的活细胞会产生极化现象。但死细胞、细胞碎片、溶解的杂质等物质由于不具有完整的精细包膜结构，不会产生极化现象。因此，对测试结果没有影响。正是由于电容式细胞检测方法的这一优点，使其在发酵过程和细胞培养过程中具有良好的应用前景。
检测限取决于活细胞总生物量的大小（与细胞数量和细胞大小有关）
05
电容式活细胞检测仪的应用
在丝状细菌检测中的应用
在利福霉素SV发酵生产过程中，菌丝体的生长代谢以及产物的发酵合成与活菌丝体的数量密切相关。文献1探索了利用在线活细胞传感器测量活细胞数量的方法。它利用细胞的介电特性来消除发酵液中固形物的干扰。测量的电容值与活细胞浓度线性相关，并且可以作为工艺优化过程中的关键参数。
在酵母菌检测中的应用
文献2：详细介绍了在线活细胞分析仪的检测原理，并重点介绍了其在毕赤酵母发酵过程中的应用。结果表明，在线活细胞分析仪可以直接、实时、在线获得发酵过程中可靠的活细胞量，并有效避免采样操作的干扰。该技术符合PAT的要求，可以与其他参数结合进行分析，作为发酵过程开发、控制和优化的有益工具。
在杆菌检测中的应用
活菌检测是益生菌培养过程分析的重要组成部分。传统的平板稀释法检测益生菌活菌数耗时耗力，且无法实现实时监测。文献3探讨了电容式活细胞在线检测仪在双歧杆菌培养过程中的应用效果，评价其检测活细胞量的可行性。研究表明，在细菌发酵生长的对数期，活细胞在线检测仪的电容值与长双歧杆菌活细胞数量之间存在良好的线性关系。其线性相关系数为0.992，比吸光度值法更准确。它准确地反映了发酵系统中活细胞的数量，并且还显示了稳定期和腐烂期之间良好的相关性。比平板计数法速度更快，并且可以实现实时监控。电导率活细胞检测器为益生菌培养过程的在线检测提供了一种简单而准确的方法。
在动物细胞检测中的应用
下图是在线和离线CHO细胞培养的活细胞浓度对比图。可以看出，从生长初期到细胞浓度达到峰值时，在线电容法的数据和离线台盼蓝染色法的数据非常一致。 （红、蓝曲线代表不同探针离线测得的数据，黑点代表离线测得的数据），但在细胞凋亡阶段会有所不同。这主要是由于这个阶段产生了凋亡小体。台盼蓝还存在染料排斥现象，导致离线测量的数据较高。
06
总结
从上面的介绍我们可以看出，与现有的在线方法和离线方法相比，在线电容方法具有以下明显的优点：
1、原位测量不需要取样，不影响细胞的生长过程。可实时准确测量动物细胞、植物细胞、放线菌、酵母、大肠杆菌等多种活细胞的浓度值。
2、测量的电容值与活细胞浓度/活细胞生物量成正比，测量不受死细胞、细胞碎片、裂解杂质等物质的影响。
3、测量结果与离线方法非常一致，测量受人为或其他干扰因素影响较小。
在线电容法活细胞浓度分析仪不仅适用于各种细菌培养，还适用于CHO SF9 Vero等各种细胞。同时，大量实验结果表明，该测量技术也适用于放线菌等原核微生物。因此在蛋白质药物、抗生素、维生素、酶、激素、疫苗等制造过程中具有巨大的应用价值。
07
参考
1.刘爱军、史守坤、李兰“基于活细胞质量测量的利福霉素发酵工艺氮源优化策略”
2.李兰，王泽建，金勇等“电容法在线测定发酵过程中毕赤酵母浓度的研究”
3.刘立桑、岳武勇等人《活细胞在线检测仪在长双歧杆菌培养中的应用研究》
4、百度文库
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